Approccio Innovativo per la rivelazione dell'uso di antibiotici nei suini

Il presente studio introduce un approccio innovativo volto alla ricerca di nuovi strumenti di valutazione dell’autenticità e di tracciabilità della filiera suina relativamente ai claim riportati sull’etichetta della carne, es. “senza antibiotici”. In tale contesto il monitoraggio dei residui di antibiotici effettuato nell’ambito del Piano Nazionale Residui non è pertinente. Pertanto, a tale scopo un approccio metabolomico untargeted, basato sull’uso della spettroscopia NMR (Nuclear Magnetic Resonance), è stato impiegato per valutare differenze metaboliche e ricercare metaboliti correlati alla somministrazione di antibiotici in suini con l’obiettivo di identificare possibili biomarker. Il disegno sperimentale ha considerato 41 suini pesanti allevati in 4 diverse aziende situate nel Nord Italia e ripartiti in un gruppo di animali di controllo (22 capi) ed un gruppo di animali trattati (19 capi) in base alla DDDAitbiomass ricavata dalla piattaforma Classyfarm riferita all’anno 2020. In particolare, le DDDAitbiomass erano 16,3 and 37,4 giorni/animale/anno per i suini provenienti dall’azienda 1 e 2 (gruppo trattati) e 0,38 e 0,14 per quelli appartenenti alle aziende 3 e 4 (gruppo controllo). In fase di campionamento si è proceduto al prelievo del fegato in quanto organo metabolicamente coinvolto in numerosi processi biologici. Adottando un protocollo operativo a due fasi, 100 mg di fegato sono stati miscelati con una soluzione metanolo/cloroformio (2:1, v/v). Dopo sonicazione in un bagno ghiaccio-acqua, un egual volume di cloroformio ed acqua è stato aggiunto ai campioni che, a seguire, sono stati centrifugati per ottimizzare la separazione del sistema bifasico. Le due fasi, polare (superiore) e apolare (inferiore), sono state trasferite separatamente in due provette distinte ed evaporate con flusso di azoto. Gli estratti ottenuti sono stati risospesi con solventi deuterati: metanolo e cloroformio, per la frazione apolare, ed un tampone fosfato in acqua deuterata e standard interno (TSP) per quella polare. Gli spettri, acquisiti utilizzando uno spettrometro NMR operante a 600,17 MHz, sono stati corretti (per la fase e la linea di base) e calibrati. I dataset sono stati generati considerando i valori di area integrata dei segnali presenti in un intervallo spettrale compreso tra 0-9 ppm. In particolare, sono stati ottenuti due dataset distinti, uno per la frazione polare ed uno per quella apolare, costituiti da 3444 e 3116 valori di area, rispettivamente. Entrambi i dataset sono stati sottoposti ad analisi statistica multivariata mediante Principal Component Analysis (PCA), e Orthogonal Partial Least Squares- Discriminant Analysis (OPLS-DA). Entrambe le rielaborazioni statistiche hanno evidenziato una netta separazione tra i due gruppi di suini ascrivibile alle variazioni relative all’abbondanza di metaboliti. Tali evidenze suggeriscono differenze metaboliche tra il gruppo di suini trattato con antibiotici ed il gruppo controllo. In particolare, 17 e 11 segnali NMR appartenenti alla frazione polare e apolare, rispettivamente, hanno mostrato un effetto discriminante significativo tra i due gruppi e sono attualmente oggetto di identificazione ed interpretazione biologica. I risultati ottenuti in questa prima fase dello studio rappresentano un elevato potenziale per l’identificazione di biomarcatori di trattamenti antibiotici utili per l’autenticazione e la tracciabilità nella filiera suina ed aprono ampie prospettive di ricerca.