Studio proteomico dei meccanismi di formazione di biofilm in Staphylococcus Aureus

Numerosi batteri patogeni hanno dimostrato capacità di formare bio-film. Tra questi, particolare rilevanza in ambito clinico ed alimentareriveste Staphylococcus aureus(S.a). Il biofilm può essere definitocome una comunità sessile di batteri, irreversibilmente adesa ad unasuperficie, immersa in una matrice extracellulare composta dasostanze polimeriche prodotte dalle cellule stesse e caratterizzata dauna alterato fenotipo ed espressione genica. Attualmente, approcciavanzati innovativi quali ad esempio l’analisi proteomica volta adapprofondire la particolare fisiologia dei microrganismi in forma ses-sile rispetto alla forma planctonica sta riscuotendo un notevole suc-cesso. Studi recenti hanno dimostrato, infatti, che l’espressione pro-teica delle cellule batteriche organizzate in forma sessile rivela alte-razioni rispetto alla forma planctonica. Lo scopo del nostro studio èstato quello di identificare proteine differenzialmente espresse inceppi produttori di biofilm di S.a in forma planctonica e in forma ses-sile. L’indagine è stata condotta sui ceppi di riferimento di S.a. (altiproduttori, basso produttori di biofim). Per la forma planctonica èstata allestita una cultura overnight in Trypticase Soy Broth. La produ-zione del biofilm è stata allestita su piastrine di polistirene sterili a37°C in accordo ad un nostro precedente protocollo. Per ogni cepposono stati analizzati 3 replicati biologici, in particolare 50 mg di pelletbatterico è stato diluito in 500 microlitri di tampone di reidratazione(7M urea, 2M tiourea, 2% CHAPS) e 500 mg di sferette di Zirconio(BioSpec Products inc, USA). I campioni sono stati processati con 5cicli da 1 minuto ciascuno (bead beating) intervallato da 5 minuti inghiaccio e 2 minuti di centrifugazione (2°C, 14000 rpm). 100 micro-grammi di estratto proteico è analizzato in elettroforesi bidimensiona-le ad alta risoluzione, colorato con Comassie staining Colloidale el’analisi delle immagini digitalizzate è stata effettuata con il softwarededicato Progenesis Same Spots (Non linear dinamics). Le proteinedifferenzialmente espresse, escisse dal gel 2D, sono state digeritemediante tripsina e i peptidi analizzati mediante spettrometria dimassa MALDI TOF(Ultraflex III, Bruker) in modalità reflectron positiva.Gli spettri di massa ottenuti, caratteristici di ciascuna proteina (spot),sono stati processati mediante il software Flex Analysis 3.3 e la listadi picchi ottenuta (m/z) analizzati mediante l’algoritmo Mascot v.2.4utilizzando il database Swiss Prot _2015_05 selezionato per la tas-sonomia Staphylococcus aureus(bacteria). Per l’identificazione sonostati utilizzati i seguenti parametri di ricerca: tolleranza di massa 50ppm, carbamidometilazione della cisteina fra le modificazioni variabilie ossidazione della metionina fra le modificazioni fisse. I risultati evi-denziano l’espressione differenziale di 8 proteine comuni ai dueceppi presi in considerazione. Tra le 8 proteine identificate oggettodell’analisi, si evidenziano l’alcool deidrogenasi, la putative long chainfatty acid CoA ligasi e la Inosina 5 monofosfato deidrogenasi cheaumentano nelle condizioni sessili (quindi in fase di formazione bio-film). Queste proteine c forniscono nuove chiavi di lettura in meritoalla produzione di biofilm, in particolare il coinvolgimento di molecoledel quorum sensing (inosina 5 monofosfato deidrogenasi), la resi-stenza ai disinfettanti (alcool deidrogenasi), il potenziamento dellalipofilicità e la difficoltà di penetrazione dell’acqua e antimicrobici(LCFACoA ligasi).