Studio del meccanismo di aggregazione e dei processi di disidratazione del collagene tramite simulazioni di dinamica molecolare e misure di spettroscopia FTIR e UV

Questo lavoro di tesi ha come oggetto il collagene di tipo I (Rattus norvegicus), proteina fibrosa che rappresenta il principale costituente del tessuto connettivo nei mammiferi. La sua unità di base, il tropocollagene, consiste in una tripla elica di un migliaio di residui, tipicamente composta da ripetizioni della tripletta Gly-Xaa-Yaa, in cui le posizioni Xaa e Yaa sono occupate per il 30% da proline e da idrossiproline. Dall’unione di più tropocollageni, che aggregano con uno sfasamento di circa 234 residui nella sequenza, si formano le fibrille, che a loro volta si organizzano in fibre. In questo studio sono stati approfonditi due aspetti, ossia il meccanismo di aggregazione e il processo di disidratazione del collagene, mediante simulazioni di dinamica molecolare (MD) e spettroscopia UV e FTIR. Nel primo studio, abbiamo seguito sperimentalmente l’aggregazione del collagene mediante misure di torbidità a 310 nm, a tre diversi pH (5.0, 7.0 e 8.0), osservando un processo più lento a pH neutro. In parallelo, sono state implementate simulazioni di MD variando la forza ionica, per monitorare l’aggregazione di due, tre e quattro frammenti, sfasati di 234 residui, dopo aver selezionato dalla sequenza del collagene due regioni con diversa idropaticità, ovvero poco cariche (LC) e molto cariche (HC). In concentrazione salina fisiologica, l’aggregazione dei frammenti poco carichi avviene spontaneamente e non richiede un ordine sequenziale mentre quella dei frammenti molto carichi avviene con difficoltà e richiede sequenzialità. A bassa forza ionica invece prevalgono le interazioni elettrostatiche tra tropocollageni adiacenti, guidando, nella maggior parte dei casi, una veloce e non corretta aggregazione, che provoca uno shift dei tropocollageni. Quello che emerge da questo studio è che in condizioni fisiologiche, un’aggregazione più lenta che inizia dalle regioni poco cariche e che è guidata da interazioni idrofobiche è necessaria per una fibrilllogenesi corretta e sequenziale. Il secondo studio ha avuto come obiettivo la determinazione dei cambiamenti indotti dal processo di disidratazione del collagene, dal momento che la mancanza di acqua causa danni anche irreversibili nelle molecole di collagene. Abbiamo eseguito simulazioni di MD sulle due tipologie, LC e HC, di microfibrille di collagene fatte aggregare precedentemente, dapprima disidratate fino alla prima shell di idratazione, ovvero mantenendo solo un layer di molecole d'acqua di 3 Å attorno alla proteina (idratazione di 0.42/0.49 g/g) e poi reidratate totalmente. In condizioni di disidratazione la struttura del collagene viene ad assumere una forma più compatta e tubulare e l'acqua si ridistribuisce sulla superficie raggruppandosi in cluster principalmente attorno a residui carichi, con tempi di permanenza maggiori. Reidratando, il collagene è in grado recuperare i suoi aspetti strutturali inziali, probabilmente per effetto delle molecole d'acqua che, anche in condizioni di disidratazione, erano rimaste intrappolate all'interno della struttura evitando il collasso della fibrilla. Anche l’acqua ritorna ad avere la mobilità e la distribuzione iniziale. In parallelo, abbiamo eseguito misurazioni FTIR e gravimetriche sul campione di collagene sottoposto ad un trattamento di disidratazione-reidratazione, in cui il campione raggiungeva una disidratazione spinta (0.02 h). Le isoterme di desorbimento/adsorbimento dell’acqua mostrano un’isteresi, indicando che la distribuzione dell’acqua nel campione non corrisponde a quella nello stato iniziale. Dall’analisi della banda Amide I osserviamo un aumento della struttura beta dopo l’intero trattamento, indicando una crescita di aggregati fibrillari e/o un aumento di compattezza, in accordo con i risultati delle simulazioni. Alla luce di ciò, possiamo ipotizzare che una disidratazione moderata fino a 0.42/0.49 h induca nel collagene cambiamenti reversibili, mentre una pesante disidratazione (come 0.02 h) causi un irreversibile collasso della struttura del collagene, probabilmente dovuta alla perdita delle molecole d'acqua intrappolate all'interno.