La Nutlin-3 potenzia l’effetto citotossico del trattamento combinato con gli inibitori di MEK1 e l’arsenico triossido in cellule di Leucemia Acuta

Nelle cellule primarie di Leucemia Mieloide Acuta (AML), il pathway Ras/Raf/MAPK è spesso costitutivamente attivato, conferendo alle cellule vantaggi in termini di sopravvivenza e proliferazione; il blocco di MEK inibisce crescita e proliferazione cellulare e down-regola l’espressione di numerosi fattori anti-apoptotici, riducendo così la soglia apoptotica; tuttavia il blocco di MEK rende le cellule leucemiche sensibili, in maniera efficiente e selettiva, a dosi sub-ottimali di numerosi agenti anticancro, sia convenzionali che innovativi. Proprio in questo contesto è stato dimostrato che inibitori di MEK (PD184352, PD98059, PD325901) sensibilizzano blasti primari AML all’apoptosi indotta da Triossido di Arsenico (ATO) via p73, paralogo di p53, e l’attivazione del pathway pro-apoptotico di Bad. Inoltre è stato anche dimostrato che alte dosi di ATO (2microM) inducono l’accumulo di p53, con un incremento di più del doppio rispetto al controllo, in 11 su 21 pazienti (52%), indicando un possibile contributo del pathway di p53 nell’induzione dell’apoptosi in seguito al trattamento combinato PD+ATO sui blasti. Mutazioni di TP53 sono piuttosto rare in AML (5-10%) e MDM2 (murine double minute 2), il suo principale gene regolatore, è frequentemente stato trovato overespresso in AML, processo questo che può aumentare attivamente il potenziale tumorigenico e la resistenza all’apoptosi. Dato che, in cellule AML, gli inibitori di MEK possono aumentare la funzione proapoptotica nucleare di p53 oltre a quella di p73, lo scopo di questo studio è stato quello di investigare se la Nutlin-3, una piccola molecola antagonista di MDM2, potente e selettiva, poteva potenziare l’effetto apoptotico degli inibitori di MEK in combinazione con ATO, nelle cellule AML che overesprimono MDM2 e con p53 wild type. L’apoptosi è stata valutata tramite saggi di misurazione del contenuto di DNA Sub-G1, legame con annessina V e valutazione del potenziale mitocondriale transmembrana. Abbiamo prima analizzato le interazioni farmacologiche tra Nutlin-3, PD e ATO (0, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, or 10 micro M) usando una fixed-ratio (1:1:1 o 1:2:4) su cellule AML OCI-AML-3 e MOLM-13, entrambe con una p53 wild-type. Abbiamo osservato che la combinazione dei tre farmaci (NUT/PD/ATO) ha mostrato un più forte sinergismo citotossico rispetto alla combinazione PD/ATO indicando che l’inibizione dell’interazione tra p53 e MDM2, mediata dalla Nutlin-3, può influenzare positivamente l’effetto pro-apoptotico delle cellule trattate con PD e ATO: l’indice di combinazione medio (CI) calcolati dall’ED50 (50% effective dose), ED75 e ED90, con NUT/PD/ATO rispetto a cellule trattate con PD/ATO è 0.36± 0.03 contro 0.72±0.02 e 0.28±0.11 contro 0.50±0.15 rispettivamente per le OCI-AML-3 e per le MOLM-13. Al fine di indagare gli effettori molecolari coinvolti nell’apoptosi indotta da Nultina/PD/ATO o da PD/ATO, abbiamo inizialmente studiato la cinetica di p53, p73 a 2, 12, 24, e 48 ore nelle cellule OCI-AML-3 e MOLM-13. In assenza di Nutlin-3, ATO, anche ad alte dosi, non promuoveva un accumulo di p53 mentre modulava l’espressione genica di p73 attraverso l’induzione del isoforma pro-apoptotica e anti-proliferativa TAp73, e delle isoforma anti-apoptotica e pro-proliferativa ΔNp73, mantenendo in questo modo inalterato il rapporto TA/ ΔNp73. Al contrario, il trattamento con PD riduceva i livelli di ΔNp73 e fermava l’up-regolazione ATO mediata di ΔNp73 causando così un incremento del rapporto TA/ΔNp73 nelle cellule sottoposte a doppio trattamento (PD/ATO). In particolare, in cellule AML trattate con PD/ATO, l’aggiunta di Nutlin-3 non solo aumenta i livelli della proteina p53 ma anche induceva una forte riduzione di ΔNp73, dominante negativo di p53 wild-type e TAp73, portando ad un aumento di espressione dei geni target di p73/p53 come P53AIP1 e Puma e la perdita del potenziale di membrana mitocondriale. Infine, abbiamo dimostrato che la Nutlin-3 aumentava significativamente l'attività antileucemica del PD/ATO nella maggior parte dei blasti leucemici provenienti da 14 diversi casi di AML analizzati ex vivo. Nel complesso questi risultati suggeriscono che il pathway pro-apoptotico p73, coinvolto nell’efficacia del trattamento PD/ATO, può essere potenziato dall’attivazione del pathway p53 in cellule AML che possiedono un pathway p53 funzionale e fornisce una spiegazione razionale per una effettiva e relativamente specifica strategia terapeutica per la AML.