Effetti sinergici ed antagonisti dei modulatori della risposta stringente ppGpp e DksA sulla struttura del complesso di inizio della trascrizione batterica

In condizioni favorevoli alla crescita ed alla proliferazione i batteri utilizzano buona parte delle risorse energetiche per la sintesi proteica. Tuttavia, l’adattamento a situazioni ambientali non ottimali è stato garantito dall’evoluzione di meccanismi che permettono un rapido cambiamento del profilo di espressione genica, rendendoli capaci di indirizzare le scarse risorse disponibili verso nuove esigenze metaboliche. In E. coli e nella maggior parte dei procarioti questo fenomeno prende il nome di “risposta stringente” ed è mediato da due modulatori che agiscono direttamente sull’RNA polimerasi (RNAP): l’alarmone ppGpp e la proteina DksA. Mentre la DksA è sempre presente nelle cellule ad una concentrazione costante, la concentrazione intracellulare di ppGpp dipende dalle condizioni ambientali, venendo prodotto ad elevati livelli solo in condizioni di stress. Inoltre, in base al principio secondo il quale l’attivazione della risposta stringente è indicativa delle condizioni metaboliche della cellula ospite, alcuni batteriofagi temperati, tra cui il batteriofago lambda, hanno evoluto meccanismi di regolazione dell’espressione genica legati alla scelta lisi-lisogenia mediati dal ppGpp e dalla DksA. In letteratura sono riportate numerose evidenze a supporto dell’ipotesi secondo cui ppGpp e DksA agiscono influenzando la cinetica di formazione del complesso aperto; tuttavia, rimangono ancora da chiarire i dettagli strutturali alla base di tale effetto. Allo scopo di investigare le modificazioni conformazionali dell’RNAP associate al legame degli effettori della risposta stringente, in questo lavoro di tesi è stata impiegata la microscopia a forza atomica per effettuare un’approfondita analisi conformazionale dei complessi di inizio della trascrizione, valutando in particolare l’estensione dell’interazione tra l’RNAP e le sequenze upstream di diversi promotori (wrapping del DNA). Sono stati presi in considerazione due dei sette promotori che controllano la sintesi degli rRNA in E. coli, rrnB P1 e rrnA P1, ed il promotore PR del batteriofago lambda, responsabile dell’attivazione del ciclo litico. La scelta di questi promotori è motivata da diversi fattori, tra cui il fatto che essi risultano fortemente regolati da ppGpp e DksA, che sono stati estensivamente caratterizzati sia in vivo che in vitro e che mostrano differenze significative nella stabilità del complesso aperto e nell’interazione tra RNAP e regioni upstream. L’analisi e l’interpretazione dei dati raccolti ha permesso di dimostrare che il ppGpp e la DksA, a concentrazioni saturanti, modificano l’affinità tra l’RNAP ed i promotori, anche se ciò dipende dallo specifico promotore considerato e dalla concentrazione dei nucleotidi iniziatori. Sui promotori rrnB P1 e rrnA P1 il ppGpp non influenza il wrapping del DNA che, al contrario, risulta significativamente ridotto dalla DksA, sia quando questa viene aggiunta da sola che quando viene aggiunta insieme all’alarmone. Inoltre, è stato osservato che l’aggiunta di un largo eccesso di nucleotidi iniziatori elimina l’effetto della DksA. Sul promotore PR il ppGpp provoca una riduzione significativa del wrapping del DNA, mentre la DksA non sembra avere effetti, ma mitiga l’effetto negativo dell’alarmone quando aggiunta contestualmente ad esso. Questi risultati supportano un modello secondo il quale il ppGpp riduce l’affinità tra RNAP e promotore legandosi all’interfaccia tra le subunità beta’ ed omega, riducendo la mobilità relativa tra le subunità beta e beta’ ed impedendo il corretto alloggiamento del DNA nel sito attivo dell’enzima con conseguente inibizione dell’isomerizzazione a complesso aperto. La DksA sembra invece interferire con il corretto posizionamento dei nucleotidi nel sito attivo dell’RNAP riducendo in questo modo la stabilità del complesso aperto, ma solo a livello di promotori che presentano un complesso aperto instabile, come per esempio i promotori rrn.