Perchè Arabidopsis thaliana possiede tre geni che codificano per l'enzima NAD(H)-GDH? Analisi fisiologica, strutturale e filogenetica dell'isoforma 3 (GDH3).

Nelle piante superiori, l’enzima glutammato deidrogenasi NAD(H)-dipendente [NAD(H)-GDH] è molto abbondante e si presenta in diverse isoforme a localizzazione prevalentemente mitocondriale. Il modello genetico prevalente è basato sull’esistenza di due geni che codificano per due subunità che associandosi casualmente danno origine a sette diverse isoforme attive composte ciascuna da sei subunità. Esistono tuttavia alcune eccezioni rispetto a questo modello. In Arabidopsis thaliana sono stati individuati tre geni Gdh1,Gdh2 e Gdh3 (quest’ultimo isolato recentemente) che codificano per tre diverse subunità (, e ) la cui oligomerizzazione casuale dà origine a un pattern complesso di omo- e etero-esameri. Questo fatto è particolarmente curioso in quanto questa specie possiede un genoma piccolo e compatto se confrontato a quello di altre piante superiori: situazione che dovrebbe corrispondere a una riduzione delle copie duplicate di geni che codificano per la stessa funzione a meno che il mantenimento di una molteplicità di membri in una famiglia genica fornisca un vantaggio in termine di fitness all’organismo nel suo ambiente. Vi sono diverse evidenze sperimentali che attribuiscono alla NAD(H)-GDH, che catalizza la reazione di amminazione reversibile dell’-chetoglutarato a glutammato, un ruolo essenzialmente catabolico. Tuttavia l’esistenza di diverse isoforme con localizzazione dipendente dallo stadio di sviluppo e dalle condizioni nutrizionali impone un supplemento di indagine in particolare per quanto riguarda le isoforme che dipendono dall’espressione del gene Gdh3 la cui individuazione, come si è detto, è piuttosto recente. In questo lavoro abbiamo utilizzato sia piante wt che mutanti singoli (gdh1 e gdh2) e doppi (gdh1-2) nei geni per la NAD(H)-GDH di A. thaliana al fine di monitorare 1) le variazioni del profilo isoenzimatico durante le diverse fasi dello sviluppo; 2) l’influenza della disponibilità di Azoto, Carbonio, e la loro interazione con le citochinine, sulla attività delle isoforma GDH3; e infine, 3) abbiamo analizzato le caratteristiche di stabilità termica della isoforma GDH3 mettendola a confronto con le altre isoforme dell’enzima. Per quanto riguarda il primo punto: abbiamo osservato che l’isoforma GDH3 è espressa prevalentemente nelle radici di piante adulte (poco prima dell’antesi) e negli stami dei boccioli fiorali. Per quanto riguarda il secondo punto: i nostri dati indicano che l’isoforma GDH3 è indotta nelle radici delle piante sottoposte a carenza di azoto, ma solo se è disponibile una fonte di carbonio e/o di luce. Le citochinine mimano e amplificano questo effetto suggerendo l’esistenza di un network regolativo in cui GDH3 potrebbe svolgere un ruolo importante come sensore dello stato nutrizionale (C/N status) con particolare riferimento ai processi di riallocazione delle risorse durante la senescenza. Per quanto riguarda il terzo punto: abbiamo osservato che, in A.thaliana, gli omo- ed etero-esameri contenenti subunità sono meno stabili al trattamento termico di quelli costituti da subunità  e/o . Il confronto delle sequenze aminoacidiche dedotte dai rispettivi cDNA e dalle sequenze di tutte le NAD(H)-GDH di piante disponibili in banche dati, ha mostrato l’esistenza di particolari residui aminoacidici nella regione carbossi-terminale della sub unità di Arabidopsis. Abbiamo quindi espresso in lievito sia proteine wt che chimeriche di GDH1 e GDH3 recanti le opportune sostituzioni reciproche degli aminoacidi della regione carbossi-terminale delle subunità  e L'analisi della stabilità termica di questi diversi isoenzimi ha confermato un ruolo dei residui aminoacidici in questione nel condizionare la stabilità dell’omoesamero. Abbiamo inoltre analizzato il profilo isoenzimatico della NAD(H)-GDH di diverse piante appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae al fine di ottenere evidenze della possibile presenza di un analogo del gene Gdh3 di A. thaliana: il risultato di questa indagine ha sorprendentemente mostrato che nessuna delle specie oggetto di studio presenta tale isoforma che può invece essere osservata in due ecotipi di A. thaliana che differiscono per la loro capacità di rispondere alla carenza di azoto.