Effetto della rapamicina sull’aumento di trasporto di Arginina indotto da TNFalpha in HSVEC

Introduzione. Nelle cellule endoteliali umane di vena safena (HSVECs) il trasporto di arginina è riconducibile all’attività dei sistemi di trasporto y+, riferibile all’espressione dei geni SLC7A1/CAT1 e SLC7A2/CAT2, e del sistema y+L (inibibile da leucina in presenza di Na+) riferibile all’espressione dei geni SLC7A6/y+LAT2 e SLC7A7/y+LAT1. Studi condotti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che il TNFalpha stimola il trasporto di L-arginina attraverso il sistema y+ e che tale effetto è riconducibile ad un aumento dell’espressione di SLC7A2/CAT2 mentre SLC7A1/CAT1 non subisce apprezzabili variazioni. L’effetto della citochina è mediato dall’attivazione del fattore di trascrizione NF-kB. In questo studio dimostriamo che il trattamento di HSVECs con rapamicina, un potente inibitore specifico della chinasi mTOR utilizzato come immunosoppressore, potenzia l’effetto del TNFalpha sull’attività di trasporto del sistema y+, aumentando fortemente l’espressione di SLC7A2/CAT2. Materiali e Metodi. Le cellule, coltivate in medium M199 contentente il 20% di siero bovino fetale, 50 ug/ml di Endothelial Cell Growth Supplement e 75 U/ml di eparina, sono state incubate per 8 o 18h in presenza o in assenza di TNFalpha (10ng/ml) con l’aggiunta, un’ora prima del trattamento, di rapamicina 100 nM. L’attività di trasporto del sistema y+ è stata misurata come uptake di 3H-arginina (0.1 mM; 4uCi/ml) determinato in presenza di leucina 2 mM. L’espressione dei geni SLC7A1/CAT1 e SLC7A2/CAT2 è stata analizzata in RT-qPCR. L’analisi del recettore TNFR-1 e della molecola di adesione ICAM-1 è stata effettuata mediante Western Blotting dopo biotinilazione delle proteine di membrana. Risultati e Discussione. In HSVECs il TNFalpha induce un aumento (+100%) dell’attività del sistema y+. L’aumento è visibile già dopo 9 ore di trattamento e persiste anche dopo 24 ore. La stimolazione del trasporto di arginina è associata ad un forte incremento dell’espressione degli mRNA per CAT2A e CAT2B, ottenuti dallo splicing alternativo del trascritto di SLC7A2, mentre variazioni non significative si osservano per SLC7A1. In presenza di TNFalpha, il trattamento con rapamicina induce un forte aumento del trasporto di arginina, 3-4 volte superiore rispetto ai valori di controllo, associato ad una sovraespressione dei geni codificanti CAT2A e CAT2B. In assenza di TNFalpha la rapamicina non produce apprezzabili cambiamenti nè dell’attività del sistema y+, nè dell’espressione dei geni relativi. Il potenziamento degli effetti della citochina da parte di rapamicina non è limitato all’espressione di CAT2, in quanto anche l’espressione della molecola di adesione ICAM-1 è aumentata notevolmente dal trattamento combinato con TNFalpha e rapamicina. Il meccanismo responsabile di questi effetti sembra coinvolgere l’up-regulation di TNFR-1: l’analisi Western mostra infatti un aumento del recettore in presenza di TNFalpha, rapamicina o di entrambi. Questi risultati indicano che l’inibizione della protein-chinasi mTOR produce, in cellule endoteliali da macrocircolo, effetti pro-infiammatori sinergici con quelli del TNFalpha.