Messa a punto di una nested-PCR per identificare ceppi di P. ovale con polimorfismo genetico nel 18S rDNA

Introduzione. L’utilizzo di saggi di PCR per la diagnosi di malaria ha evidenziato un aumento della prevalenza in Italia dei casi d’infezione da P.ovale (Po) sottostimata nel passato mediante microscopia. In precedenza abbiamo descritto la presenza di ceppi di Po probabilmente mutati nel 18S-rDNA che possono non essere rivelati dai saggi di PCR basati su questo bersaglio. Qui riportiamo la descrizione di una nuova coppia di primers per l’identificazione di questi ceppi di Po. Metodi. Centosette campioni di sangue di pazienti con sospetta malaria (microscopia: 9 P.falciparum (Pf), 12 P.vivax (Pv), 7 Po, 3 P.malariae (Pm), 1 Pv/Po, 2 P.spp., 73 negativi) sono stati sottoposti a 18S-rDNA-PCRs (nested- PCR genere-specifica, nested-PCR-1993, -2002) per Pf, Pv, Po e Pm. In questo studio è stata disegnata una nuova coppia di primers (rOVA1B, rOVA2B) (nested-PCR-2005) tenendo conto delle mutazioni osservate in alcuni ceppi di Po nella sequenza bersaglio dei primers usati nella nested-PCR-1993. I nuovi primers sono stati valutati su 1 campione positivo per Pf, Pv, Pm rispettivamente e 1 negativo per plasmodi, e utilizzati per verificare la presenza di ceppi di Po mutati nei campioni biologici. Risultati. La nested-PCR-2005 è stata la sola in grado di identificare correttamente Po nei 23 campioni di sangue in cui era presente: 20 ottenuti da casi con infezione singola e 3 da casi con infezione mista (2 Pf+Pm+Po e 1 Pf+Po). La nested-PCR-1993 e la nested-PCR-2002 hanno identificato 14 e 17 ceppi di Po, rispettivamente. Conclusioni. Una corretta diagnosi di laboratorio di malaria non può prescindere dall’impiego combinato dell’esame microscopico e di appropriati metodi molecolari. I risultati ottenuti nel nostro studio indicano che alcune infezioni da Po possono essere non diagnosticate non solo dall’esame microscopico ma anche da alcuni saggi di PCR aventi come bersaglio il gene 18S-rDNA a causa della presenza di un polimorfismo genetico presente in questa regione.