Introduzione. Indagini molecolari avanzate si stanno dimostrando sempre più utili nella diagnosi di infezione da microrganismi patogeni di interesse medico, quando opportunamente affiancate a quelle tradizionali, dirette (microscopia e coltura) e indirette (sierologia). Al fine di migliorare sensibilità, specificità ed efficacia dei saggi per la diagnosi di laboratorio di infezione da spirochete patogene è stato deciso di introdurre nel nostro laboratorio, reazioni di PCR per la rivelazione del DNA di Borrelia burgdorferi sensu lato, Leptospira spp. e Treponema pallidum, rispettivamente. Materiali e metodi. Sono state ampiamente valutate sensibilità, specificità ed efficacia dei tre saggi seguenti: il primo (nested-PCR in singolo tubo) allestito in casa per amplificare un frammento genico di Borrelia burgdorferi sensu lato; il secondo (nested-PCR “16SrRNA”) allestito in casa per amplificare un frammento genico di Leptospira spp.; il terzo (nested-PCR “Treponema pallidum <bmp>”, Amplimedical S.p.A.) saggio commerciale per amplificare un frammento del gene “bmp” che codifica per una proteina di membrana del batterio. Risultati e conclusioni. I saggi di PCR si sono tutti rivelati altamente sensibili, specifici ed efficaci. Il saggio nested- PCR in un singolo tubo potrà essere applicato sia nella diagnosi di laboratorio rapida di malattia di Lyme al fianco delle procedure tradizionali come l’esame colturale, lungo e indaginoso, e l’esame sierologico, poco sensibile e poco specifico, sia per escludere l’infezione in casi di sospetta borreliosi. Il saggio “16SrRNA” è risultato essere un efficace strumento diagnostico da applicare alla diagnosi di laboratorio di leptospirosi, specialmente durante i primi giorni dell’infezione quando altri saggi diagnostici risultano poco sensibili e poco specifici. Infine, il saggio “Treponema pallidum <bmp>”, data l’impossibilità di coltivare il batterio in vitro, può assumere un ruolo fondamentale nella diagnosi dei casi di lue nei quali le indagini sierologiche sono di dubbia interpretazione o non applicabili, sia per escludere l’infezione in casi sospetti.