Allo scopo di superare gli svantaggi dei metodi convenzionali di riferimento per la diagnosi di laboratorio di leptospirosi (esame colturale e saggio di microagglutinazione) è stato introdotto nel nostro laboratorio un saggio di nested-PCR che si è rivelato sensibile e specifico per Leptospira spp. ma non in grado di differenziare leptospire patogene da quelle saprofite. A questo scopo, un recente saggio “Real-time PCR” per la rivelazione delle sole leptospire patogene è stato sottoposto a valutazione nel nostro laboratorio. La sua specificità è stata valutata su colture pure di leptospire saprofite e di leptospire patogene. La sensibilità è stata valutata su campioni simulati di sangue addizionati di L. interrogansAustralis bratislava Riccio-2. Le sospensioni di leptospire così ottenute sono state sottoposte a diluizioni seriali e analizzate mediante saggio “Real-time PCR” che prevede l’amplificazione di una sequenza interna al 16S rDNA e rivelazione della fluorescenza condotte in “ABI Prism 7000 sequence detector” (Applied Biosystem). Nel nostro laboratorio, il saggio “Real-time PCR” è stato ottimizzato attraverso la definizione delle condizioni sperimentali (concentrazione dei “primers” e della sonda, e il numero di cicli di PCR) e ha mostrato una buona sensibilità per L. interrogans (CT 27,82) (Std Dev. CT 0,139). Rispetto al saggio nested-PCR, questo procedimento realizzato in un unico tubo garantisce una maggiore sicurezza contro eventuali contaminazioni, ha un tempo di esecuzione rapido (2 ore rispetto a 7-8 ore per il saggio nested-PCR), è specifico per le specie patogene e, attualmente, sufficientemente sensibile e semiautomatizzato.

Un saggio di “Real-time PCR (TaqMan)” per la diagnosi di laboratorio di leptospirosi / Calderaro, Adriana; Incaprera, M.; Piccolo, Giovanna; Arcangeletti, Maria Cristina; Medici, Maria Cristina; Dettori, Giuseppe; Chezzi, Carlo. - In: MICROBIOLOGIA MEDICA. - ISSN 1120-0146. - 19:(2004), pp. 193-193. (Intervento presentato al convegno XXXIII Congresso Nazionale dell’Associazione Microbiologi Clinici Italiani (AMCLI). tenutosi a Padova nel 8-11 GIUGNO 2004).

Un saggio di “Real-time PCR (TaqMan)” per la diagnosi di laboratorio di leptospirosi

CALDERARO, Adriana;PICCOLO, Giovanna;ARCANGELETTI, Maria Cristina;MEDICI, Maria Cristina;DETTORI, Giuseppe;CHEZZI, Carlo
2004-01-01

Abstract

Allo scopo di superare gli svantaggi dei metodi convenzionali di riferimento per la diagnosi di laboratorio di leptospirosi (esame colturale e saggio di microagglutinazione) è stato introdotto nel nostro laboratorio un saggio di nested-PCR che si è rivelato sensibile e specifico per Leptospira spp. ma non in grado di differenziare leptospire patogene da quelle saprofite. A questo scopo, un recente saggio “Real-time PCR” per la rivelazione delle sole leptospire patogene è stato sottoposto a valutazione nel nostro laboratorio. La sua specificità è stata valutata su colture pure di leptospire saprofite e di leptospire patogene. La sensibilità è stata valutata su campioni simulati di sangue addizionati di L. interrogansAustralis bratislava Riccio-2. Le sospensioni di leptospire così ottenute sono state sottoposte a diluizioni seriali e analizzate mediante saggio “Real-time PCR” che prevede l’amplificazione di una sequenza interna al 16S rDNA e rivelazione della fluorescenza condotte in “ABI Prism 7000 sequence detector” (Applied Biosystem). Nel nostro laboratorio, il saggio “Real-time PCR” è stato ottimizzato attraverso la definizione delle condizioni sperimentali (concentrazione dei “primers” e della sonda, e il numero di cicli di PCR) e ha mostrato una buona sensibilità per L. interrogans (CT 27,82) (Std Dev. CT 0,139). Rispetto al saggio nested-PCR, questo procedimento realizzato in un unico tubo garantisce una maggiore sicurezza contro eventuali contaminazioni, ha un tempo di esecuzione rapido (2 ore rispetto a 7-8 ore per il saggio nested-PCR), è specifico per le specie patogene e, attualmente, sufficientemente sensibile e semiautomatizzato.
2004
Un saggio di “Real-time PCR (TaqMan)” per la diagnosi di laboratorio di leptospirosi / Calderaro, Adriana; Incaprera, M.; Piccolo, Giovanna; Arcangeletti, Maria Cristina; Medici, Maria Cristina; Dettori, Giuseppe; Chezzi, Carlo. - In: MICROBIOLOGIA MEDICA. - ISSN 1120-0146. - 19:(2004), pp. 193-193. (Intervento presentato al convegno XXXIII Congresso Nazionale dell’Associazione Microbiologi Clinici Italiani (AMCLI). tenutosi a Padova nel 8-11 GIUGNO 2004).
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