Un saggio di “Real-time PCR (TaqMan)” per la diagnosi di laboratorio di leptospirosi

Allo scopo di superare gli svantaggi dei metodi convenzionali di riferimento per la diagnosi di laboratorio di leptospirosi (esame colturale e saggio di microagglutinazione) è stato introdotto nel nostro laboratorio un saggio di nested-PCR che si è rivelato sensibile e specifico per Leptospira spp. ma non in grado di differenziare leptospire patogene da quelle saprofite. A questo scopo, un recente saggio “Real-time PCR” per la rivelazione delle sole leptospire patogene è stato sottoposto a valutazione nel nostro laboratorio. La sua specificità è stata valutata su colture pure di leptospire saprofite e di leptospire patogene. La sensibilità è stata valutata su campioni simulati di sangue addizionati di L. interrogansAustralis bratislava Riccio-2. Le sospensioni di leptospire così ottenute sono state sottoposte a diluizioni seriali e analizzate mediante saggio “Real-time PCR” che prevede l’amplificazione di una sequenza interna al 16S rDNA e rivelazione della fluorescenza condotte in “ABI Prism 7000 sequence detector” (Applied Biosystem). Nel nostro laboratorio, il saggio “Real-time PCR” è stato ottimizzato attraverso la definizione delle condizioni sperimentali (concentrazione dei “primers” e della sonda, e il numero di cicli di PCR) e ha mostrato una buona sensibilità per L. interrogans (CT 27,82) (Std Dev. CT 0,139). Rispetto al saggio nested-PCR, questo procedimento realizzato in un unico tubo garantisce una maggiore sicurezza contro eventuali contaminazioni, ha un tempo di esecuzione rapido (2 ore rispetto a 7-8 ore per il saggio nested-PCR), è specifico per le specie patogene e, attualmente, sufficientemente sensibile e semiautomatizzato.