Diverse indagini molecolari avanzate si stanno dimostrando sempre più utili nella diagnosi di laboratorio di infezione da microrganismi patogeni di interesse medico, quando opportunamente affiancate a quelle tradizionali, dirette (microscopia, coltura) e indirette, (ricerca di anticorpi specifici). In questo studio verranno presentati, a titolo esemplificativo, i risultati ottenuti presso il nostro laboratorio durante la messa a punto, validazione e applicazione di indagini molecolari avanzate alla diagnosi di laboratorio di infezioni sostenute da protozoi di interesse medico (Entamoeba histolytica, E. dispar, plasmodi della malaria, Toxoplasma gondii). Infezioni da E. histolytica e E. dispar - Nel nostro laboratorio la diagnosi di infezione da E. histolytica viene correntemente effettuata mediante metodo tradizionale (esame colturale ed esame microscopico) affiancati da unaa reazione di amplificazione genica (PCR “rRNA-ssu”) rapida, sensibile e specifica. Soltanto grazie all’uso del metodo molecolare sono stati diagnosticati alcuni casi di amebiasi che altrimenti sarebbero stati misconosciuti: nel primo caso, è stato dimostrato il DNA di E. histolytica nell’aspirato da ascesso epatico di un paziente con addome acuto e appendicite complicata di incerta eziologia; in un secondo caso, il DNA del protozoo è stato evidenziato in prelievi bioptici della mucosa colica di un paziente contemporaneamente al DNA di batteri enteropatogeni (B. pilosicoli e B. aalborgi) dimostrando, per la prima volta in assoluto, una coinfezione da ameba e spirochete intestinali. Inoltre, con questo metodo molecolare è stato possibile identificare Entamoeba dispar, ameba intestinale non patogena e morfologicamente indiffereziabile da E. histolytica, isolata in coltura e/o osservata in preparati microscopici diretti da campioni di feci di pazienti con sospetta parassitosi intestinale. Infezioni da plasmodi della malaria (P. falciparum (P.f.), P. vivax (P.v.), P. malariae (P.m.) e P. ovale (P.o.)) - Una reazione di amplificazione genica (nested-PCR specie-specifica, 18S rDNA) per la diagnosi di laboratorio di malaria, utilizzata nel nostro laboratorio da circa 5 anni a fianco delle indagini tradizionali e valutata su 443 campioni di 325 pazienti, si è rivelata più sensibile e specifica dell’esame microscopico, soprattutto nei casi di bassa parassitemia, e ha consentito di diagnosticare infezioni miste altrimentinon rivelabili. Inoltre, da circa 1 anno è in uso quotidiano nel nostro laboratorio la real-time PCR (“18S rDNA”), valutata per Plasmodium spp. e per P.f., P.v. e P.o. su 163 campioni di sangue da pazienti con sospetta malaria, che si è rivelata sensibile, specifica, rapida, di semplice esecuzione. Per i notevoli vantaggi offerti da questo sistema, esso ha sostituito la nested- PCR per l’identificazione di P. spp. e dei tre plasmodi P.f., P.v. e P.o. e attualmente, la reazione nested-PCR è in uso esclusivamente per la ricerca e identificazione di P. malariae. La disponibilità di tali metodi molecolari avanzati ha consentito di organizzare in modo proficuo il flusso di lavoro. In particolare, la real-time PCR eseguita parallelamente all’esame microscopico e ad un saggio immunocromatografico rapido per la ricerca degli antigeni di plasmodi su tutti i campioni pervenuti in laboratorio per sospetta malaria, permette in un tempo rapido (3 ore) e con un costo di 30-40 Euro per reazione, di ottenere una conferma del risultato microscopico soprattutto nei casi critici (bassa parassitemia, infezioni miste). Infezioni da T. gondii - Solo grazie all’uso di una reazione di amplificazione genica (nested-PCR speciespecifica, “gene B1”) è stato possibile diagnosticare un caso di toxoplasmosi cerebrale in un paziente immunodepresso con sierologia di dubbia interpretazione e sospetta toxoplasmosi all’esame istopatologico e di escludere l’infezione in altri casi di sospetta toxoplasmosi congenita. La nested-PCR viene vantaggiosamente impiegata (su campioni di liquido cefalo-rachidiano, sangue periferico e materiale bioptico), infatti, nel nostro laboratorio per la diagnosi di toxoplasmosi in quei casi in cui i metodi indiretti (sierologia) sono poco affidabili come può accadere nei soggetti immunocompromessi oppure per porre una diagnosi prenatale (liquido amniotico). In conclusione, la descrizione di tutti questi casi vuole soprattutto richiamare l’attenzione sul ruolo fondamentale che hanno assunto le indagini molecolari nel Laboratorio di Parassitologia Clinica grazie alle quali è possibile effettuare una rapida e corretta diagnosi utilizzando anche campioni biologici per i quali le indagini parassitologiche tradizionali potrebbero fornire risultati non interpretabili (esempio campioni prelevati durante o dopo le somministrazione di terapia antiparassitaria, campioni prelevabili in quantità ridotta non sufficiente per indagini tradizionali).

Indagini molecolari avanzate per la diagnosi di laboratorio di infezioni da protozoi / Calderaro, Adriana. - In: MICROBIOLOGIA MEDICA. - ISSN 1120-0146. - 19:(2004), pp. 130-130. (Intervento presentato al convegno XXXIII Congresso Nazionale dell’Associazione Microbiologi Clinici Italiani (AMCLI). tenutosi a Padova nel 8-11 GIUGNO 2004).

Indagini molecolari avanzate per la diagnosi di laboratorio di infezioni da protozoi

CALDERARO, Adriana
2004-01-01

Abstract

Diverse indagini molecolari avanzate si stanno dimostrando sempre più utili nella diagnosi di laboratorio di infezione da microrganismi patogeni di interesse medico, quando opportunamente affiancate a quelle tradizionali, dirette (microscopia, coltura) e indirette, (ricerca di anticorpi specifici). In questo studio verranno presentati, a titolo esemplificativo, i risultati ottenuti presso il nostro laboratorio durante la messa a punto, validazione e applicazione di indagini molecolari avanzate alla diagnosi di laboratorio di infezioni sostenute da protozoi di interesse medico (Entamoeba histolytica, E. dispar, plasmodi della malaria, Toxoplasma gondii). Infezioni da E. histolytica e E. dispar - Nel nostro laboratorio la diagnosi di infezione da E. histolytica viene correntemente effettuata mediante metodo tradizionale (esame colturale ed esame microscopico) affiancati da unaa reazione di amplificazione genica (PCR “rRNA-ssu”) rapida, sensibile e specifica. Soltanto grazie all’uso del metodo molecolare sono stati diagnosticati alcuni casi di amebiasi che altrimenti sarebbero stati misconosciuti: nel primo caso, è stato dimostrato il DNA di E. histolytica nell’aspirato da ascesso epatico di un paziente con addome acuto e appendicite complicata di incerta eziologia; in un secondo caso, il DNA del protozoo è stato evidenziato in prelievi bioptici della mucosa colica di un paziente contemporaneamente al DNA di batteri enteropatogeni (B. pilosicoli e B. aalborgi) dimostrando, per la prima volta in assoluto, una coinfezione da ameba e spirochete intestinali. Inoltre, con questo metodo molecolare è stato possibile identificare Entamoeba dispar, ameba intestinale non patogena e morfologicamente indiffereziabile da E. histolytica, isolata in coltura e/o osservata in preparati microscopici diretti da campioni di feci di pazienti con sospetta parassitosi intestinale. Infezioni da plasmodi della malaria (P. falciparum (P.f.), P. vivax (P.v.), P. malariae (P.m.) e P. ovale (P.o.)) - Una reazione di amplificazione genica (nested-PCR specie-specifica, 18S rDNA) per la diagnosi di laboratorio di malaria, utilizzata nel nostro laboratorio da circa 5 anni a fianco delle indagini tradizionali e valutata su 443 campioni di 325 pazienti, si è rivelata più sensibile e specifica dell’esame microscopico, soprattutto nei casi di bassa parassitemia, e ha consentito di diagnosticare infezioni miste altrimentinon rivelabili. Inoltre, da circa 1 anno è in uso quotidiano nel nostro laboratorio la real-time PCR (“18S rDNA”), valutata per Plasmodium spp. e per P.f., P.v. e P.o. su 163 campioni di sangue da pazienti con sospetta malaria, che si è rivelata sensibile, specifica, rapida, di semplice esecuzione. Per i notevoli vantaggi offerti da questo sistema, esso ha sostituito la nested- PCR per l’identificazione di P. spp. e dei tre plasmodi P.f., P.v. e P.o. e attualmente, la reazione nested-PCR è in uso esclusivamente per la ricerca e identificazione di P. malariae. La disponibilità di tali metodi molecolari avanzati ha consentito di organizzare in modo proficuo il flusso di lavoro. In particolare, la real-time PCR eseguita parallelamente all’esame microscopico e ad un saggio immunocromatografico rapido per la ricerca degli antigeni di plasmodi su tutti i campioni pervenuti in laboratorio per sospetta malaria, permette in un tempo rapido (3 ore) e con un costo di 30-40 Euro per reazione, di ottenere una conferma del risultato microscopico soprattutto nei casi critici (bassa parassitemia, infezioni miste). Infezioni da T. gondii - Solo grazie all’uso di una reazione di amplificazione genica (nested-PCR speciespecifica, “gene B1”) è stato possibile diagnosticare un caso di toxoplasmosi cerebrale in un paziente immunodepresso con sierologia di dubbia interpretazione e sospetta toxoplasmosi all’esame istopatologico e di escludere l’infezione in altri casi di sospetta toxoplasmosi congenita. La nested-PCR viene vantaggiosamente impiegata (su campioni di liquido cefalo-rachidiano, sangue periferico e materiale bioptico), infatti, nel nostro laboratorio per la diagnosi di toxoplasmosi in quei casi in cui i metodi indiretti (sierologia) sono poco affidabili come può accadere nei soggetti immunocompromessi oppure per porre una diagnosi prenatale (liquido amniotico). In conclusione, la descrizione di tutti questi casi vuole soprattutto richiamare l’attenzione sul ruolo fondamentale che hanno assunto le indagini molecolari nel Laboratorio di Parassitologia Clinica grazie alle quali è possibile effettuare una rapida e corretta diagnosi utilizzando anche campioni biologici per i quali le indagini parassitologiche tradizionali potrebbero fornire risultati non interpretabili (esempio campioni prelevati durante o dopo le somministrazione di terapia antiparassitaria, campioni prelevabili in quantità ridotta non sufficiente per indagini tradizionali).
2004
Indagini molecolari avanzate per la diagnosi di laboratorio di infezioni da protozoi / Calderaro, Adriana. - In: MICROBIOLOGIA MEDICA. - ISSN 1120-0146. - 19:(2004), pp. 130-130. (Intervento presentato al convegno XXXIII Congresso Nazionale dell’Associazione Microbiologi Clinici Italiani (AMCLI). tenutosi a Padova nel 8-11 GIUGNO 2004).
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