Monitoraggio immunologico in pazienti con epatite B cronica sottoposti a interruzione della terapia antivirale preceduta da trattamento immunomodulante con agonista del toll-like receptor 8

L’infezione cronica da HBV (CHB) rimane un rilevante problema di sanità pubblica con una stima di 3 milioni di decessi attribuibili alle epatiti virali nel 2022, di cui l’83% riconducibili all’HBV. La terapia con analoghi nucleos(t)idici (NUC) sopprime efficacemente la replicazione virale e riduce il rischio di progressione della malattia, ma non eradica completamente il virus e solo raramente si associa alla perdita di HBsAg. La persistenza del virus contribuisce al fenomeno di exhaustion linfocitaria, limitando la funzionalità delle risposte T e B HBV-specifiche. In questo contesto l’obiettivo primario è la cura funzionale, definita come perdita di HBsAg con o senza sieroconversione. A questo scopo diverse strategie terapeutiche sono attualmente allo studio, tra cui anche la possibilità di ripristinare una risposta T efficace. Recentemente anche la sospensione programmata dei NUC in pazienti selezionati ha mostrato, in una quota di casi, di favorire il recupero della funzionalità T antivirale e la conseguente risoluzione dell’infezione. Il laboratorio di Immunopatologia Virale dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma ha preso parte ad un progetto europeo multicentrico, finalizzato a testare l’efficacia della sospensione dei NUC in seguito a trattamento con l’agonista del toll-like-receptor 8 (TLR8) Segantolimod in pazienti con CHB. Un primo trial multicentrico di fase II e studi su modelli marmotta e in vitro hanno evidenziato la capacità di Selgantolimod di attivare la risposta immunitaria innata e adattativa. Il trial clinico previsto dal presente studio è durato 76 settimane. I campioni analizzati nella presente tesi provengono da 22 pazienti, che all’arruolamento sono stati randomizzati in 3 bracci: A - terapia antivirale con NUC (controllo); B - sospensione dei NUC alla settimana 28; C - assunzione di Segantolimod fino alla settimana 24 e sospensione dei NUC alla settimana 28. Lo scopo della tesi è stato quello di monitorare longitudinalmente le risposte T linfocitarie nei tre bracci di trattamento e caratterizzare il fenotipo e la frequenza dei linfociti B HBV-specifici. La funzionalità T è stata valutata mediante saggio Fluorospot a tre colori (IFN-γ, TNF-α, IL-2) e saggio di Intracellular Cytokine Staining (ICS) in citofluorimetria per analizzare in dettaglio le sottopopolazioni T linfocitarie CD4 e CD8 in relazione allo stop dei NUC e all’esposizione a Selgantolimod. La frequenza e il fenotipo dei linfociti B HBV-specifici sono stati studiati in citofluorimetria utilizzando bait fluorescenti S- e core-specifici per identificare selettivamente i linfociti B antigene specifici. L’analisi mediante FluoroSpot indica che nei pazienti pretrattati con Selgantolimod (braccio C) la produzione di citochine, in particolare di IL-2, aumenta maggiormente rispetto sia ai soggetti in sola terapia NUC (braccio A) sia a quelli che hanno interrotto i NUC senza immuno-agonista (braccio B), con un incremento funzionale concentrato soprattutto sulle risposte dirette contro core e polimerasi e una reattività verso S sostanzialmente invariata. I dati ICS mostrano due pattern distinti: nel braccio B prevale la componente T CD4, con aumenti modesti di IFN-γ, TNF-α e IL-2 a fronte di CD8 stabili o in lieve calo; nel braccio C, al contrario, emerge una risposta più marcatamente CD8-mediata, caratterizzata da una produzione significativamente maggiore di IFN-γ (in particolare dopo stimolazione con polimerasi) e da trend favorevoli per IL-2 e TNF-α, mentre la componente CD4 rimane globalmente stabile. Per ciascun braccio di trattamento, è stata valutata la polifunzionalità, intesa come la capacità delle popolazioni T linfocitarie di co-produrre più citochine in risposta allo stimolo antigenico. Complessivamente, l’analisi dei dati Fluorospot e ICS indica che il pretrattamento con selgantolimod si associa a un aumento selettivo della polifunzionalità T, soprattutto a carico dei CD4 diretti contro core e polimerasi, mentre lo stop dei NUC senza immuno-agonismo si accompagna a un profilo funzionale globalmente meno favorevole. Relativamente al monitoraggio dei linfociti B HBV-specifici, il pretrattamento con Selgantolimod non determina variazioni di frequenza, ma si associa a un riassetto qualitativo dei comparti di memoria. In particolare, nel braccio C, per i linfociti B S-specifici, che al baseline risultano maggiormente arricchiti in cellule “atypical memory”, associate alla disfunzione, si osserva uno spostamento significativo verso subset di tipo “active memory” e “resting memory” nel secondo periodo di monitoraggio, mentre per quelli core-specifici si registra un incremento delle cellule di memoria attiva, suggerendo lo sviluppo di una memoria B più competente nei confronti di entrambi gli antigeni. In conclusione, nonostante i limiti di numerosità campionaria e il carattere esplorativo dello studio, i profili virologici e immunologici osservati suggeriscono che il pretrattamento con Selgantolimod associato allo stop mirato dei NUC possa favorire un assetto immunologico più favorevole al controllo di HBV, fornendo segnali preliminari che giustificano ulteriori studi in coorti più ampie di pazienti.