Disfunzione endoteliale e compromissione polmonare nel COVID-19: meccanismi patogenetici alla base dell’infezione da SARS-CoV-2

Il presente lavoro di tesi è stato condotto presso il Laboratorio di Patologia Generale del dipartimento di Medicina e Chirurgia dell’Università di Parma. Lo studio ha analizzato i meccanismi patogenetici alla base della disfunzione polmonare e vascolare associata al COVID-19, patologia causata dal virus SARS-CoV-2. Numerose evidenze indicano che la forma grave della malattia è caratterizzata da una insufficienza multiorgano correlata ad uno stato iperinfiammatorio (la cosiddetta "tempesta di citochine") in combinazione con uno stato protrombotico. Tuttavia, i meccanismi patogenetici alla base della risposta iperinfiammatoria che contribuisce al danno epiteliale alveolare ed endoteliale rimangono ad oggi solo parzialmente compresi. L’obiettivo del presente lavoro di tesi è stato quello di studiare la risposta dell’epitelio alveolare e dell’endotelio umano alla proteina Spike di SARS-CoV-2. A tal fine le cellule endoteliali microvascolari ed epiteliali alveolari sono state esposte direttamente alla proteina Spike S1 oppure incubate con il medium condizionato ottenuto da macrofagi umani pretrattati con la proteina Spike S1 (CM_S1). Tale disegno sperimentale ha riprodotto in vitro l’effetto del virus SARS-CoV-2 sulle cellule, sia diretto come infezione virale, sia immunomediato dalla presenza di citochine infiammatorie prodotte da macrofagi. Per quanto riguarda le cellule epiteliali alveolari (linea A549), l’analisi del profilo infiammatorio dopo trattamento diretto con diverse concentrazioni di Spike S1 ha evidenziato una significativa secrezione di alcuni mediatori dell’infiammazione solo alla dose più elevata, pari a 50 nM; la concentrazione di 10 nM, corrispondente indicativamente al livello plasmatico di Spike S1 nei soggetti affetti, non produce invece nessuna attivazione cellulare. Al contrario, il trattamento delle cellule alveolari con CM_S1 induce marcatamente l’espressione genica di varie citochine. Sono stati quindi approfonditi specificamente i processi cellulari e molecolari legati alla modulazione immunomediata del fenotipo infiammatorio nelle cellule A549. Preliminarmente, sono stati valutati eventuali effetti citotossici del CM_S1. Tale trattamento causa cambiamenti morfologici accompagnati da un evidente arresto proliferativo in fase G0/G1 con induzione di autofagia. L’analisi di un altro marcatore notoriamente associato ad un fenotipo epiteliale attivato, cioè iNOS, ha riportato una notevole induzione di questo enzima da parte del CM_S1. È stato inoltre possibile attribuire questi effetti alla presenza simultanea delle citochine IFNγ, IL-1 e TNFα con attivazione dei pathway molecolari attivati dai fattori di trascrizione NF-κB, STAT e AP-1. Utilizzando le cellule A549 IRF1 KO è stato inoltre dimostrato che, negli effetti mediati dal CM_S1, il fattore di trascrizione IRF1, a valle del pathway JAK-STAT, gioca un ruolo chiave, in particolare per l’induzione di iNOS. È stato infine valutato l’effetto del baricitinib, farmaco approvato dalla FDA nel trattamento della forma grave di COVID-19. Tale farmaco, inibitore di JAK-STAT, si è rivelato efficace nel contrastare l’aumento di IRF1 e dei geni coinvolti nella degradazione proteasoma-dipendente e nel ridurre l’autofagia. Coerentemente, in presenza di baricitinib, i cambiamenti cambiamenti morfologici delle cellule A549 indotti dopo esposizione a CM_S1 risultano attenuati ed il numero delle cellule parzialmente ristabilito. Complessivamente, questi dati suggeriscono: 1. un ruolo chiave della via JAK/STAT/IRF1, nelle cellule epiteliali alveolari, nel mediare gli effetti citostatici prodotti dalle citochine infiammatorie secrete dai macrofagi attivati dalla proteina Spike S1; 2. il farmaco baricitinib si dimostra efficace nel proteggere l’attivazione delle cellule alveolari da citochine infiammatorie. Nella seconda parte di questo lavoro è stata valutata la risposta dell'endotelio alla proteina virale, sia a seguito della esposizione diretta delle cellule endoteliali alla Spike S1, sia dopo il trattamento con CM_S1. I risultati ottenuti indicano che l’incubazione delle cellule endoteliali con la sola proteina S1 induce significativamente l'espressione di marcatori tipici di attivazione endoteliale, quali le molecole di adesione ICAM-1 e VCAM-1, nonché delle chemochine infiammatorie CCL2/MCP-1 e CXCL10/IP-10. Questa attivazione risulta nettamente amplificata quando le cellule endoteliali vengono incubate con CM_S1, con un concomitante aumento dei marcatori endoteliali pro-coagulanti. In parallelo il trattamento con questo medium condizionato provoca una significativa riduzione della proliferazione cellulare, accompagnata da evidenti segni di citotossicità. Esplorando i meccanismi molecolari alla base degli effetti antiproliferativi/pro-apoptotici del CM_S1, le proteine p21 e Rb risultano implicate. Allo scopo di approfondire i meccanismi coinvolti nelle complicanze vascolari associate all’infezione da SARS-CoV-2, l’attenzione si è poi concentrata sull’analisi del metabolismo dell’arginina nelle HUVEC (human umbelical vascular endothelial cells) che, da studi di letteratura su pazienti con COVID-19, risulta essere disfunzionale. I risultati ottenuti dimostrano che il terreno condizionato CM_S1 modula l'espressione di eNOS e dell’arginasi, con una soppressione quasi completa dei livelli di NOS3/eNOS ed un concomitante aumento dell'espressione dell’arginasi. Per quanta riguarda lo studio dei pathways JAK-STAT/IRF1 ed NF-κB in relazione al danno cellulare delle HUVEC, i risultati dimostrano che la compromissione della vitalità endoteliale è riconducibile, almeno in parte, all'attivazione congiunta di tali vie di segnalazione. Partendo da questi risultati e considerando gli effetti protettivi del baricitinib sulle cellule epiteliali alveolari, lo studio si è concluso valutando l’efficacia di tale farmaco nella modulazione della risposta infiammatoria endoteliale da CM_S1. Il baricitinib si è rivelato inefficace nel contrastare l’induzione di VCAM-1 e solo parzialmente funzionante su ICAM-1. Diversamente, previene completamente l'induzione di IL-6, IP-10 e RANTES. Alla luce dei risultati si può concludere che, nel COVID-19, l’insorgenza della disfunzione alveolare ed endoteliale abbia alla base sia un effetto citopatico diretto mediato dal virus SARS-CoV-2, sia effetti indiretti, mediati dalla presenza di citochine secrete da macrofagi attivati dalla proteina Spike. I dati ottenuti sostengono inoltre un ruolo promettente del farmaco baricitinib, efficace nel limitare la risposta immunomediata delle cellule epiteliali alveolari ed endoteliali.