Le alterazioni del metabolismo della glutamina nella nicchia midollare del mieloma multiplo modificano il differenziamento delle cellule mesenchimali stromali

Il mieloma multiplo (MM) è un tumore ematologico maligno caratterizzato dalla proliferazione incontrollata di una popolazione monoclonale di plasmacellule nel midollo osseo. Il MM si sviluppa da una condizione pre-maligna (MGUS, gammopatia monoclonale di significato indeterminato) passando attraverso uno stadio intermedio asintomatico (SMM, Smouldering Multiple Myeloma) che, in circa il 10% dei pazienti, evolve a MM attivo. Le manifestazioni cliniche dell’insufficienza d’organo tipiche del MM attivo sono riassunte nell’acronimo CRAB: ipercalcemia (C), insufficienza renale (R), anemia (A) e malattia ossea (B). Come noto, le cellule tumorali alterano le vie metaboliche allo scopo di garantire la disponibilità di una quantità di energia e di precursori sufficiente alla proliferazione cellulare, favorendo nel contempo la crescita del tumore e l’evasione dal controllo del sistema immunitario. In questo contesto la glicolisi aerobia, che converte il glucosio in acido lattico anche in presenza di ossigeno, e la glutaminolisi, che produce prima glutamato (Glu) e poi α-chetoglutarato (α-KG) a partire dalla glutamina (Gln), sono tra le principali vie metaboliche attivate nei tumori maligni. La Gln è un aminoacido importante per molti tipi di cellule neoplastiche, tra cui le plasmacellule di MM, che vengono definite “glutamine addicted” in quanto sviluppano una forte dipendenza da Gln e ne consumano grandi quantità. Un modo che le cellule hanno per aumentare la disponibilità di Gln è sintetizzarla de novo grazie all’enzima Glutamina Sintetasi (GS) a partire da Glu e ammonio; tale enzima però non è espresso nelle plasmacellule maligne, che risultano quindi totalmente dipendenti dalla disponibilità di Gln extracellulare. Infatti, diversi sistemi di trasporto, come i carriers Na+-dipendenti ASCT2 e SNAT1, e lo scambiatore Na+-indipendente LAT1, risultano sovraespressi durante la progressione del MM. Fondamentali nel microambiente del MM sono le cellule mesenchimali stromali (MSC) che, in condizioni normali, sono in grado di differenziarsi in osteoblasti, adipociti e condrociti. Nel midollo osseo di MM, viene stimolato il differenziamento in senso adipocitario delle MSC, un’alterazione funzionale a favorire la crescita del tumore grazie agli acidi grassi secreti dagli adipociti. Al contrario, il differenziamento in senso osteoblastico delle MSC risulta compromesso dalla deplezione di Gln, consumata dalle cellule di MM, evento che determina un mancato equilibrio tra riassorbimento e sintesi di matrice ossea. Non sono invece ancora chiariti gli eventuali rapporti tra deplezione di Gln e differenziamento adipocitario delle MSC, così come non è stato indagato se alterazioni del metabolismo dell’aminoacido possano essere coinvolte in altri disordini del tessuto osseo. Ad esempio, recenti studi hanno indicato che l’integrità ossea può essere compromessa anche da una sovraproduzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) mediata da nanoplastiche (NPs), microscopici inquinanti ambientali in grado di raggiungere, tra i vari tessuti, anche il midollo osseo. Questa tesi studia il ruolo delle cellule mesenchimali stromali nel metabolismo della glutamina del mieloma multiplo, caratterizzando i meccanismi attraverso cui queste cellule sostengono il metabolismo delle cellule neoplastiche e sono indotte a un differenziamento in senso adipocitario. L’interesse per le capacità differenziative delle cellule mesenchimali stromali del midollo osseo mi ha inoltre portata ad indagare se le nanoplastiche di polistirene possano modificarle e se, in questo caso, alterazioni del metabolismo della glutamina possano essere coinvolte. Nello studio sono state impiegate le linee cellulari di MM umano (HMCL) MM1.S, RPMI8226, JJN3 e U266 e cellule mesenchimali stromali umane primarie (MSC), o immortalizzate (hTERT-MSC). Le cellule sono state coltivate in monocoltura o in co-coltura utilizzando sistemi a doppia camera (transwell) con le cellule di MM nel compartimento superiore e le MSC nel compartimento inferiore. La vitalità cellulare è stata determinata tramite il saggio della Resazurina. Il differenziamento delle MSC è stato promosso tramite incubazione per 14 giorni in medium contenente acido ascorbico (ASC, 50 μg/mL), desametasone (Dex, 10-8 M) e 10% di siero fetale bovino (FBS) per il differenziamento osteogenico o 10% di FBS, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX, 500 μM), indometacina (INDO, 5 μM), Dex (50 μM) e insulina ricombinante umana (10 μg/mL) per il differenziamento adipogenico. Per evidenziare e quantificare la presenza delle gocce lipidiche all’interno delle MSC in seguito al differenziamento adipocitario è stata utilizzata la colorazione Oil Red O. L’attività dei trasportatori EAATs (trasportatori Na+-dipendenti in grado di concentrare attivamente Glu all’interno delle cellule) e xCT (scambiatore Na+-indipendente cistina/Glu) è stata valutata utilizzando substrati radioattivi marcati. Per quanto riguarda EAATs, abbiamo valutato l’uptake di L-[3,4-3H]-Glu (10 μM, 10 μCi/ml, 1 minuto) in EBSS (soluzione salina di Earle) o in EBSS privo di Na+ e abbiamo misurato la radioattività contenuta negli estratti cellulari tramite uno spettrometro a scintillazione liquida. Abbiamo eseguito il medesimo procedimento anche per misurare l'uptake di 3H-Glu (50 μM, 10 μCi/ml, 1 minuto) attraverso il trasportatore xCT in EBSS privo di Na+, in assenza o in presenza di sulfasalazina (SSZ, 500 μM), un inibitore specifico del trasportatore. L’espressione genica è stata valutata tramite RT-PCR, dopo estrazione e retrotrascrizione dell’RNA, mentre l’espressione proteica è stata valutata mediante Western Blot o immunofluorescenza. Gli effetti delle NPs sono stati valutati incubando le cellule con nanoparticelle di polistirene (PS). Gli aminoacidi sono stati valutati tramite spettrometria di massa, avvalendosi della collaborazione del dott. Saverio Tardito e della prof. Roberta Andreoli. Abbiamo preliminarmente riscontrato, attraverso l’utilizzo di Gln marcata con l’isotopo stabile del C 13C, che le cellule di MM internalizzano la Gln che viene in misura significativa deamidata dalla Glutaminasi (GLS) a Glu, il quale viene poi secreto tramite l’attività del trasportatore xCT. Valutando l’uptake di Glu in hTERT-MSC e in osteoblasti, abbiamo riscontrato che nelle cellule non differenziate il trasporto è per la maggior parte sodio-dipendente, quindi ascrivibile ai trasportatori EAATs. Dalla successiva analisi dei livelli di espressione dei trasportatori SLC1A1 (codificante per EAAT3), SLC1A2 (codificante per EAAT2) e SLC1A3 (codificante per EAAT1), abbiamo rilevato un aumento dell’espressione del solo EAAT3 nelle MSC indifferenziate ma non negli osteoblasti. Valutando la secrezione di Gln da MSC e osteoblasti, abbiamo dimostrato che le MSC secernono una quantità doppia di aminoacido rispetto agli osteoblasti e che tale fenomeno è potenziato dall’aggiunta di Glu extracellulare, ma inibito sia dall’MSO, inibitore irreversibile di GS, sia da D-Asp, inibitore competitivo degli EAATs. Infine, abbiamo dimostrato che le MSC sostengono la crescita e la vitalità delle cellule di MM attraverso la secrezione di Gln; infatti, co-coltivando le cellule di MM con le MSC, abbiamo osservato che la co-coltura consente alle cellule di MM di adattarsi meglio alla mancanza di Gln nell’ambiente extracellulare; il sostegno metabolico è compromesso sia dall’inibizione di GS e di EAAT3 che dal silenziamento di GLUL e di SLC1A1. In merito allo studio dell’induzione del differenziamento adipocitario delle MSC nel contesto tumorale del MM, tramite l’utilizzo di medium condizionati da HMCL abbiamo riscontrato che la deprivazione di Gln stimola l’adipogenesi. In particolare, l’espressione di geni coinvolti nella lipogenesi (PPARG, ADIPOQ, FABP4 e FASN) aumenta significativamente; risultato che suggerisce che il microambiente tumorale, caratterizzato da un’alterata disponibilità dei nutrienti, possa promuovere l’adipogenesi. A conferma di questa ipotesi, valutando direttamente l’effetto della deprivazione di Gln sul differenziamento adipocitario tramite un’incubazione di 14 giorni in medium adipogenico in presenza o in assenza di Gln, l’analisi dell’espressione genica ha rivelato un aumento significativo dei principali markers adipocitari e di enzimi coinvolti nella lipogenesi nelle cellule coltivate in carenza dell’aminoacido, risultato successivamente confermato dall’aumento di positività al colorante lipofilo Oil Red O. Successivamente, abbiamo valutato l’espressione di geni chiave nel metabolismo della Gln ed è emerso un calo di espressione di GLS e un aumento di GLUL nelle cellule incubate in medium adipogenico, risultato che evidenzia da un lato la diminuzione del catabolismo della Gln e dall’altro una minor dipendenza dalla Gln extracellulare. Inoltre, il medium adipogenico privo di Gln ha determinato l’aumento a livello proteico di markers adipogenici (ADIPOQ e FABP4), l’attivazione di risposte cellulari a stress nutrizionale (aumento di eIF2α) e la riduzione dell’espressione del prodotto di mTOR fosfo-p70 S6K, risultati che suggeriscono che la Gln possa agire come sensore modulando il comportamento metabolico delle MSC e favorendo l’accumulo di acidi grassi. Dall’analisi del profilo aminoacidico abbiamo riscontrato infatti una significativa riprogrammazione metabolica delle MSC durante l’adipogenesi; in particolare, abbiamo osservato che il contenuto cellulare di Glu triplica nelle cellule incubate in medium adipogenico in presenza di Gln mentre subisce una riduzione del 90% in quelle incubate in assenza dell’aminoacido. Nelle stesse condizioni, il contenuto di Gln diminuisce solo del 50% nelle MSC incubate in assenza di Gln suggerendo che il Glu possa essere utilizzato per la produzione di Gln. Parallelamente, l’incubazione in medium adipogenico, indipendentemente dalla presenza o dall’assenza di Gln, ha determinato l'attivazione di percorsi anabolici alternativi nelle MSC, evidenziabili dal significativo aumento dei livelli degli aminoacidi a catena ramificata (BCAA) leucina (Leu) e isoleucina (Ile). Al contrario, la concentrazione dell’asparagina (Asn), noto aminoacido osteogenico (Chiu et al., Cancers, 2020), è diminuita nelle MSC differenziate, in particolare in quelle incubate in assenza di Gln. Infine, abbiamo dimostrato che l’aggiunta di Asn nel medium adipogenico modula negativamente l’adipogenesi, suggerendo un ruolo inibitorio di tale aminoacido nel processo di differenziamento, un dato coerente con l’attività pro-osteogenica di Asn. Per quanto riguarda gli effetti delle NPs di PS sulle hTERT-MSC, abbiamo preliminarmente dimostrato tramite microscopia confocale che le NPs vengono internalizzate dalle cellule senza alterarne la vitalità. Tuttavia, abbiamo osservato che l’incubazione in DMEM in presenza di NPs determina un’up-regolazione dei markers di stress ossidativo HO-1 (codificante per l’enzima eme ossigenasi 1) e xCT, la cui attività è risultata più elevata nelle cellule trattate con NPs rispetto al controllo. Valutando l’espressione a livello proteico di enzimi coinvolti nel metabolismo della Gln, dopo 48h di incubazione in presenza di NPs abbiamo riscontrato una diminuzione di asparagina sintetasi (ASNS) e un aumento di GS, risultato che suggerisce una possibile interferenza delle NPs sul differenziamento osteoblastico delle MSC tramite la modulazione dell’espressione di tali enzimi (Chiu et al., Cancers, 2020). In ultimo, inducendo il differenziamento delle MSC in presenza o assenza di NPs, abbiamo riscontrato che l’espressione dei markers osteogenici dimezza mentre quella dei markers adipocitari presenta una tendenza in aumento. Alla luce dei risultati ottenuti, è possibile ipotizzare un modello secondo cui la glutamine addiction delle cellule di MM è funzionale a produrre un ambiente midollare low Gln/high Glu che determina un calo della disponibilità di Asn manipolando in senso pro-tumorale il metabolismo e il differenziamento delle MSC. In particolare, viene inibito il differenziamento osteogenico mentre viene promosso quello adipogenico, funzionale a sostenere la vitalità e la proliferazione delle cellule neoplastiche attraverso la secrezione di acidi grassi. Inoltre, anche le NPs, attraverso l’induzione di un’iperproduzione di ROS, potrebbero rappresentare una nuova fonte di stress ossidativo che impatta sul microambiente osseo alterando il processo di differenziamento delle MSC. In tale contesto, la supplementazione con Asn potrebbe essere un approccio terapeutico efficace a inibire il differenziamento adipocitario delle MSC ripristinando quello osteoblastico e rallentando la progressione delle lesioni ossee.