Sistemi di trasporto basati su proteine e dotati di capacità di indirizzamento per l’inattivazione fotodinamica di microorganismi

Dall'introduzione degli antibiotici, i microrganismi hanno iniziato a sviluppare resistenza ad essi e oggigiorno, a causa dell'abuso di questi farmaci e della mancata scoperta di nuove classi di antibiotici, la resistenza antimicrobica è una delle minacce più urgenti per la salute pubblica mondiale. Tra i microrganismi, la resistenza batterica agli antibiotici è una “pandemia silenziosa” che nel 2019 ha portato alla morte di quasi 5 milioni di persone e, senza azioni e innovazioni, nel 2050 il tasso di mortalità salirà a 10 milioni. Da questo punto di vista, uno dei batteri più preoccupanti è S. aureus, classificato dall'OMS come batterio ad alta priorità. Lo scopo di questo progetto è lo sviluppo di complessi supramolecolari per la terapia fotodinamica antimicrobica mirata (aPDT) contro i batteri, in particolare S. aureus. La aPDT è una tecnica promettente per contrastare la resistenza agli antibiotici grazie alla sua rapida azione e alla sua capacità di bersagliare diverse biomolecole. Pertanto, non si prevede che i microrganismi sviluppino resistenza alla aPDT. La PDT si basa sull'utilizzo di fotosensibilizzatori (PSs), cioè molecole che possono essere eccitate dalla luce visibile di opportuna lunghezza d'onda e, dagli stati eccitati, generare specie reattive dell'ossigeno tossiche per la cellula bersaglio. Dopo la fotoeccitazione a uno stato elettronico eccitato, un PS normalmente subisce la transizione allo stato di tripletto, che può interagire con l'ossigeno molecolare in due modi diversi, per trasferimento di elettroni (tipo I) o per trasferimento di energia (tipo II), portando alla formazione di specie reattive dell'ossigeno (radicali e ossigeno singoletto, rispettivamente). Queste specie altamente reattive hanno un'azione citotossica, tramite il danneggiamento delle macromolecole biologiche presenti nelle cellule, portando alla morte cellulare. Utilizzando un approccio modulare, in questo lavoro, abbiamo sviluppato complessi supramolecolari in grado di trasportare il PS alla cellula bersaglio. Questi complessi sono formati da tre componenti: il PS, il sistema di giunzione e il sistema di indirizzamento. Il PS provoca l'azione fotocitotossica quando viene esposto alla luce visibile, e il sistema di giunzione, formato da streptavidina (una proteina tetramerica) e biotina (una vitamina), collega il PS al sistema di indirizzamento che permette di portare l'unità fotoattiva verso le cellule bersaglio. Abbiamo scelto questo approccio perché è intrinsecamente flessibile. I PSs possono essere modificati aggiungendo ad essi un gruppo chimico appropriato che sia reattivo nei confronti delle catene laterali degli amminoacidi (Lys, Cys, …) e permetta quindi di legarli alle proteine, nel nostro caso la streptavidina. A seconda del tipo di molecola/cellula bersaglio, è possibile scegliere una proteina di indirizzamento appropriata che può essere funzionalizzata con la biotina. Infine, sfruttando l'elevata affinità tra streptavidina e biotina, è possibile legare le due parti (PS-streptavidina e molecola bersaglio biotinilata) per formare il complesso supramolecolare. Abbiamo realizzato e caratterizzato due diversi complessi: uno che ha l’eosina come PS e l'anticorpo immunoglobulina G (IgG) come sistema di indirizzamento e uno che sfrutta il blu di metilene come PS e la proteina concanavalina A (ConA) come sistema di indirizzamento. Usando anisotropia di fluorescenza e FCS abbiamo confermato che entrambi i PS (EITC e MB, rispettivamente) sono legati alla streptavidina. Abbiamo caratterizzato alcune proprietà fotofisiche di EITC-streptavidina e MB-streptavidina e, in entrambi i casi, abbiamo osservato che quando il PS è legato alla proteina, tutte le rese quantiche (di fluorescenza, formazione dello stato di tripletto e formazione di ossigeno singoletto) diminuiscono. Inoltre, con la streptavidina marcata con EITC abbiamo notato che le rese quantiche diminuiscono all'aumentare del numero di molecole di PS presenti sulla stessa proteina. Usando FCS abbiamo confermato che la streptavidina marcata si lega al sistema di indirizzamento biotinilato (IgG e ConA, rispettivamente) e che quest'ultimo è necessario per bersagliare i batteri; ciò è stato ulteriormente confermato dalla fotoinattivazione in cui in assenza del sistema di indirizzamento la morte cellulare era ordini di grandezza inferiore (circa 4 log). Le misurazioni al microscopio hanno mostrato che il primo complesso bersaglia selettivamente S. aureus, mentre il secondo bersaglia sia S. aureus che E. coli. Infine, eseguendo test di fotoinattivazione abbiamo ottenuto una morte cellulare efficiente contro S. aureus con il primo complesso (8 log con 2 µM di EITC e 50 J/cm2) e una morte cellulare equivalente sia per S. aureus che per E. coli con il secondo complesso (4 log con 5 µM di MB e 200 J/cm2).