Caratterizzazione funzionale del sistema tossina-antitossina di tipo II DinJ-YafQ in Lactobacillus paracasei: la regolazione della crescita batterica come risposta adattativa allo stress

I sistemi tossina-antitossina (TA) batterici sono ampiamente distribuiti nei genomi dei batteri e degli archaea, regolano la crescita e la morte cellulare in risposta alle condizioni ambientali, sono costituiti da una tossina strutturalmente stabile, che ha effetti tossici sulla stessa cellula che l’ha sintetizzata, e da un’antitossina che ne contrasta la tossicità finchè le condizioni ambientali sono favorevoli alla crescita, i relativi geni fanno parte dello stesso operone e possono essere localizzati sul DNA cromosomico oppure sul DNA plasmidico. L’antitossina è instabile, viene degradata quando le condizioni sono ostili, con il conseguente sopravvento della tossicità della tossina, che interferisce con processi cellulari essenziali, quali la replicazione del DNA o la sintesi di proteine, determinando un rallentamento metabolico che può favorire la convergenza delle risorse cellulari verso la sopravvivenza. Sono stati identificati 8 tipi di sistemi TA, classificati sulla base della natura delle componenti (proteine o RNA) e del meccanismo con cui l’antitossina contrasta la tossicità della tossina, tra questi i più abbondanti appartengono al tipo II, in cui sia la tossina che l’antitossina sono proteine. Questo studio ha condotto la caratterizzazione funzionale del sistema TA di tipo II DinJ-YafQ nella specie L. paracasei 4366, appartenente al gruppo L. casei, nei quali un’analisi bioinformatica ha rilevato che questo sistema è il più abbondante e uno studio sull’espressione di questo sistema nelle specie in questione ha rivelato che è coinvolto nel rallentamento della crescita in risposta allo stress da alte temperature, mediato da un’attività ribonucleasica. Il sistema omologo in Escherichia coli è stato caratterizzato e l’analisi di omologia ha fornito indizi sul funzionamento del sistema oggetto di questo studio: l’antitossina DinJ, oltre a neutralizzare la tossicità di YafQ attraverso la formazione di un complesso stabile, agisce da repressore trascrizionale del proprio operone, per cui sono sintetizzate scarse quantità delle due proteine, e la degradazione dell’antitossina in risposta alle condizioni sfavorevoli comporta la derepressione del sistema e l’assenza della neutralizzazione della tossina ne determina il sopravvento della tossicità. Sono stati condotti saggi in vitro dell’attività ribonucleasica di YafQ, che ne hanno confermato l’attività. E’ stata identificata una variante di YafQ nel ceppo 2333 di L. paracasei, in cui un residuo di Asp, predetto di avere un ruolo catalitico in base all’allineamento con la sequenza omologa caratterizzata di E. coli, è sostituito da una Gly (D72G), quindi la sua attività RNAsica è stata testata in vitro e ha rivelato una riduzione dell’efficienza di taglio, confermando il ruolo catalitico di D72. Lo studio della repressione trascrizionale per azione di DinJ è stato condotto mediante EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) utilizzando un frammento di DNA contenene il promotore di dinJ-yafQ predetto di contenere il sito di legame di DinJ: la proteina lega sia come omodimero DinJ-DinJ che eterotetramero (DinJ)2-(YafQ)2, con cooperatività, una sequenza palindromica sovrapposta all’elemento –35 del promotore del proprio operone; l’analisi densitometrica e il fitting dei dati ottenuti dagli EMSA (frazione di DNA legato in funzione della concentrazione della proteina) ha permesso di ricavare il valore della KD per DinJ (60 nM), DinJ-YafQ_pa4366 (44 nM) e DinJ-YafQ_pa2333 (79 nM). Il legame del complesso è mediato da DinJ, infatti un EMSA con YafQ ha mostrato che la tossina non lega il DNA. Uno studio di mutagenesi ha rivelato l’importanza del residuo R13 di DinJ nell’interazione con il DNA: la sostituzione R13A ha determinato la perdita della capacità di DinJ di legare il proprio promotore. Un EMSA di competizione con la RNA polimerasi ha mostrato che DinJ agisce da repressore trascrizionale bloccando l’accesso dell’RNA pol al proprio promotore in modo specifico. Uno studio di mutagenesi ha dimostrato l’importanza di entrambi gli emisiti della sequenza palindromica nel legame di DinJ: la rimozione di uno dei due emisiti comporta la riduzione dell’affinità dell’antitossina per il proprio promotore, come rivelato da un EMSA con la sequenza mutata. La repressione trascrizionale mediata da DinJ è stata studiata in vivo utilizzando come gene reporter la gfp, in un sistema ricombinante in cui la ORF della proteina fluorescente è stata fusa a valle del promotore di dinJ-yafQ e l’intensità della fluorescenza è stata quantificata in seguito all’espressione di DinJ, sia wild type sia la forma mutata R13A, in assenza e in presenza di YafQ: è stato confermato che DinJ e il complesso DinJ-YafQ reprimono l’espressione del proprio operone; è risultato che DinJ R13A in vivo presenta una scarsa attività di repressore trascrizionale e che questa viene accentuata dall’interazione con YafQ. Mediante microscopia a forza atomica (AFM) è stato possibile osservare il legame specifico di DinJ-YafQ al proprio promotore, è stato possibile misurare la posizione dei complessi nucleoproteici sul DNA e confermare che si formano prevalentemente in corrispondenza della sequenza palindromica sovrapposta all’elemento -35 del promotore di dinJ-yafQ che era stata predetta essere il sito di legame di DinJ. Sono stati studiati gli stati oligomerici di DinJ, YafQ e DinJ-YafQ mediante esperimenti di crosslinking con glutaraldeide e cromatografia ad esclusione dimensionale e le informazioni acquisite sono state integrate con quelle ottenute mediante AFM: dal crosslinking e dalla cromatografia ad esclusione dimensionale risulta che DinJ in soluzione forma omodimeri, YafQ si presenta in forma monomerica, il complesso DinJ-YafQ invece, dall’analisi del crosslinking, rivela la formazione di dimeri (attribuibili a omodimeri (DinJ)2), trimeri ((DinJ)2-YafQ) e tetrameri ((DinJ)2-(YafQ)2), mentre la cromatografia ad esclusione dimensionale ha rivelato una dipendenza dalla concentrazione della capacità del complesso DinJ-YafQ di formare oligomeri, ossia a concentrazioni maggiori prevale la forma eterotetramerica, a minori concentrazioni si dissocia nel dimero DinJ-DinJ e monomeri di YafQ, invece la microscopia a forza atomica ha rivelato che, in presenza del proprio promotore, il complesso DinJ-YafQ è in grado di dare luogo a forme oligomeriche superiori, non rilevate mediante gli esperimenti di crosslinking, questo perchè ciascun tetramero lega un emisito della sequenza palindromica, e la struttura del promotore è compatibile con il simultaneo legame di entrambi i tetrameri, come supportato da un modello strutturale creato per il sistema DinJ-YafQ di L. paracasei, inoltre mediante AFM sono state individuate anche forme oligomeriche superiori a 2 tetrameri, confermando la cooperatività del legame di DinJ e DinJ-YafQ al proprio promotore.