Valutazione della correlazione tra uso di sostanze psicoattive e indicatori di metilazione del DNA e danno ossidativo agli acidi nucleici in popolazione sottoposta a stress

Le interazioni di sostanze xenobiotiche e sostanze reattive dell’ossigeno (ROS) con gli acidi nucleici possono portare alla rottura dello scheletro strutturale delle basi azotate e a loro modifiche chimiche; lo squilibrio fra la produzione dei ROS e i meccanismi di difesa antiossidanti dell'organismo, a favore della reazioni di ossidazione, viene definito come stress ossidativo. Esso è stato associato alla patogenesi ed al peggioramento di varie malattie, legate principalmente all’età, tra cui infarti, patologie cardiovascolari, malattie neurodegenerative, diabete e invecchiamento precoce. Gli effetti sul DNA rivestono una fondamentale importanza in ambito biomedico in quanto possono generare errori di appaiamento di basi durante la replicazione, risultando potenzialmente mutageni. Tra le basi del DNA e dell’RNA, la guanina è quella più facilmente esposta all’attacco del ROS idrossile, in particolare in posizione 8, mentre la citosina viene metilata in posizione 5. La peculiarità di queste modifiche è quella di impedire l’appaiamento nella replicazione del DNA formando appaiamenti errati. Il presente studio ha come obiettivo la valutazione della correlazione tra uso di sostanze psicoattive e indicatori di metilazione del DNA e danno ossidativo agli acidi nucleici in una popolazione in terapia con metadone, sottoposta a stress sostanza-correlato, in due differenti matrici: urina e saliva. Lo sviluppo della parte sperimentale ha previsto la raccolta di campioni biologici da due popolazioni diverse: 1) per quanto attiene alla matrice urinaria, le analisi sono state svolte su 39 campioni di soggetti deceduti in età adulta, di entrambi i sessi, senza malattie associate a ossidazione o metilazione degli acidi nucleici. Le analisi sono state svolte mediante utilizzo di cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa: i campioni di urina, dopo scongelamento, sono stati centrifugati e diluiti con una soluzione di acido formico in acqua contenente la miscela degli standard interni secondo un rapporto 1:3; 2) la seconda popolazione, da cui sono stati raccolti campioni di fluido del cavo orale, consiste di 66 campioni da soggetti adulti in cura presso il SerDP di Parma e di cui sono state raccolte informazioni socio-anamnestiche riguardo abitudini e stili di vita, dopo opportuno consenso informato e intervista anamnestica - con conseguente donazione volontaria del campione - per l’ analisi strumentale in spettrometria di massa: i campioni di saliva, analizzati con un metodo sviluppato per l’individuazione di biomarkers di stress ossidativi, sono stati preventivamente centrifugati e diluiti con solvente acquoso addizionato di acido formico; la preparazione è basata su due estrazioni con cartucce per estrazione in fase solida (SPE Waters e Oasis), a partire da 200 microlitri di matrice biologica. La preparazione del campione avviene in modo automatizzato con la preparazione di 8 punti di curva di calibrazione e quality controls a diverse concentrazioni. In questo studio pilota, sono state trovate alcune correlazioni tra biomarkers e sostanze d’abuso su campioni urinari di soggetti deceduti: • analiti come la Creatinina, 5OHMedCyt, Guo, dGuo, e i rapporti tra 8-oxo-Gua/Gua, 5OHMedCyt/Cyto, 8Guo/Guo, 8dGuo/dGuo possono dare un’indicazione sullo stress ossidativo provocato dall’abuso di una o più sostanze: in particolare, i valori di Gua e 5OHMedCyt sembrano essere correlati ad assunzione di tutte le sostanze in modo positivo, tranne che per le benzodiazepine; • 1-MeGua correla positivamente con i soggetti che abusano di morfina, mentre dCyt e 5-MedCyt correlano positivamente esclusivamente con soggetti che fanno abuso di cocaina, morfina e THC. Per quanto riguarda, invece, gli studi in saliva è stata evidenziata un’alta variabilità di 8-oxo-dGuo nei campioni, probabilmente in parte legata al polimorfismo genetico. Inoltre, non è stata riscontrata una correlazione fra età e livelli di 8-oxo-dGuo come singole concentrazioni, bensì con il rapporto 8-oxo-dGuo/contenuto proteico, dimostrando che l’età è un importante fattore interferente in queste misurazioni. Dalle comparazioni eseguite, gli assuntori di cocaina mostrano valori di 8-oxo-dGuo significativamente differenti se comparati ad assuntori di alcol; un trend simile si evidenzia tra i valori di 8-oxo-dGuo di eroinomani se comparati ad assuntori di alcol. Nessuna conclusione statisticamente valida può essere tratta per assuntori di THC poiché i valori associati di 8-oxo-dGuo mostrano elevata varabilità. Questo progetto ha studiato le concentrazioni e correlazioni di un pannello di biomakers indotti ossidativamente in due popolazioni e due matrici diverse, fornendo un contributo alla definizione di valori e delle concentrazioni di tali biomakers. Viene anche dimostrato il ruolo dell’età e del sesso come fattori di interferenza. L’epigenetica della tossicodipendenza e dell’abuso può rappresentare, in tal senso, un approccio molecolare e multidisciplinare per affrontare il problema. Studiare, perciò, l’effetto dell’abuso di droghe sui livelli di metilazione di specifiche regioni del promotore del gene in varie fasi e la manipolazione dell’espressione genica, può portare al livello successivo nella comprensione dei meccanismi epigenetici, aprendo così la strada a nuove frontiere per la ricerca terapeutica ed investigativa.