Functional and molecular analysis of Organic Cation Transporters (OCT/OCTN) in human airway epithelial cells

La famiglia genica SLC22 include i trasportatori OCTs (Organic Cation Transporters ) e OCTNs (Organic Cations and Zwitterions Transporters) che, presenti sulla membrana plasmatica delle cellule umane, traslocano una vasta gamma di composti endogeni di importanza fisiologica tra cui neurotrasmettitori, colina, carnitina, coenzimi ed anche numerosi farmaci. A tutt’oggi, gli studi effettuati sugli OCTs/OCTNs nelle vie aeree umane sono stati principalmente condotti su linee cellulari bronchiali o alveolari, immortali o trasformate. Nel mio progetto abbiamo studiato l’attività di questi trasportatori in modelli primari umani di cellule epiteliali delle vie aeree. A questo scopo sono stati utilizzati due modelli organotipici 3D in vitro, precisamente le EpiAirwayTM, un modello di cellule tracheali-bronchiali umane, e le EpiAlveolarTM, un sistema di epitelio alveolare composto da cellule epiteliali alveolari, cellule endoteliali polmonari e fibroblasti. Per mimare meglio le condizioni in vivo, entrambi i modelli sono stati coltivati in condizioni di interfaccia aria-liquido (Ali, Air Liquid Interface). Inoltre, la linea cellulare bronchiale Calu-3, uno dei modelli di riferimento in studi di permeabilità a farmaci, è stata utilizzata come confronto. L'attività dei trasportatori OCTs e OCTNs è stata valutata misurando rispettivamente l'uptake di 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+) e di L-carnitina, sia sul lato apicale che basolaterale dei monostrati cellulari. L'espressione genica e proteica di questi trasportatori è stata determinata attraverso misure del numero di molecole di mRNA in RT-PCR quantitativa ed attraverso analisi Western Blot. In parallelo, è stata inoltre valutata l'attività e la funzione del trasportatore ATB0,+ (codificato da SLC6A14), in quanto tale trasportatore accetta, oltre agli amminoacidi neutri e cationici, anche la carnitina. Infine è stata studiata l'interazione dei trasportatori con farmaci broncodilatatori anticolinergici. I risultati ottenuti hanno dimostrato che nelle EpiAirwayTM: - Sia OCT1 che OCT3 sono espressi e funzionali solo sulla membrana basolaterale - Il trasportatore OCTN2 è espresso e funzionale sul lato basolaterale. Questo risultato è stato supportato dall'analisi immunocitochimica che ha dimostrato una distribuzione laterale della proteina sia nelle Calu-3 che nelle EpiAirwayTM - ATB0,+ è marcatamente espresso e funzionale solo a livello apicale, come anche confermato nei quadri di analisi immunocitochimiche. - I broncodilatatori glicopirrolato e tiotropio interagiscono apicalmente con ATB0,+, mentre l'ipratropio interagisce con OCTN2 e gli OCTs sulla membrana basolaterale. - Stimoli infiammatori, quali LPS o TNFα, causano un'induzione dell'espressione e dell'attività di SLC6A14/ATB0,+. Le stesse analisi effettuate nelle EpiAlveolar™ rivelano che questi due modelli cellulari (EpiAirway™ ed EpiAlveolar™) mostrano strette somiglianze in termini di espressione ed attività di questi trasportatori ed anche di interazione con i farmaci, suggerendo che bronchi ed alveoli condividono lo stesso fenotipo. In conclusione, l'identificazione di questi trasportatori nell’epitelio respiratorio umano può aprire nuovi campi di indagine negli studi di farmacocinetica che si occupano della inalazione dei farmaci e del rilascio polmonare.