Set-up and characterization of an iPSC-derived neurocardiac co-culture model

Il sistema nervoso autonomo (ANS) regola la frequenza cardiaca, la velocità di conduzione, la forza di contrazione, la coesione dei miociti e il rilassamento del cuore. La delucidazione di come l'ANS e il sistema cardiaco interagiscono e cooperano è alla base della comprensione dei meccanismi che partecipano allo sviluppo di diverse malattie cardiache. Lo scopo di questa tesi è quello di sviluppare un modello cellulare neurocardiaco in vitro adatto allo studio dell'interazione tra l'ANS e il cuore. Per raggiungere questo obiettivo, sono state utilizzate cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). In questo lavoro, cardiomiociti (CMs) derivati da iPSC e neuroni simpatici (SNs) derivati da iPSC sono stati prodotti a partire dalla stessa linea di iPSC. I CMs derivati da iPSC mostrano un'attività di battito spontaneo ed esprimono i tipici marcatori cardiaci come l'α-actinina, la troponina I e la catena pesante della miosina 7, come evidenziato dall'analisi genica e proteica. I SNs derivati da iPSC, ottenuti riproducendo un protocollo disponibile in letteratura, sono stati caratterizzati dettagliatamente mediante RT-PCR, citometria a flusso, Western Blot, immunofluorescenza e analisi con MEA. I risultati hanno confermato la derivazione di cellule appartenenti al lineage neuronale simpatico, mostrando l'espressione dei marcatori noradrenergici PHOX2B, TH e DBH. Le cellule caratterizzate sono state poi impiegate per la creazione di un modello neurocardiaco. Le condizioni di co-cultura sono state ottimizzate a partire dalla composizione del mezzo, la densità delle cellule, la strategia di coating e la distribuzione spaziale. Dopo 3-5 giorni di co-cultura con CMs, i SNs derivati da iPSC formano prolungamenti degli assoni TH-positivi verso la popolazione cardiaca, mostrando positività anche per il marcatore Synapisin, intorno alla formazione di connessioni con CMs derivati da iPSC. Esperimenti funzionali preliminari sembrano indicare che la presenza di SNs derivati da iPSC inducano all' aumento del battito dei CMs derivati da iPSC quando coltivati insieme per un periodo di due settimane. Lo sviluppo di questo metodo di co-cultura e le osservazioni preliminari effettuate, forniscono un promettente modello cellulare in vitro per un'indagine più profonda dell'interconnessione neurocardiaca e per delucidazioni future nello sviluppo di modelli di molti disturbi cardiaci.