Identificazione e caratterizzazione di un nuovo sistema tossina-antitossina isolato dal L. rhamnosus

RIASSUNTO Nei batteri, la regolazione della crescita e della morte cellulare è molto importante in diverse condizioni di stress. In ambiente ostile, i batteri potrebbero sacrificare una sottopopolazione cellulare per permettere la sopravvivenza della popolazione batterica nel suo insieme (Shahar Amita et al.,2009). I sistemi tossina-antitossina (TA) hanno un ruolo importante nella regolazione della sopravvivenza cellulare in quanto sono in grado di arrestare la crescita delle cellule o di indurre morte cellulare. La maggior parte dei batteri contiene dei locus TA nei loro genomi, presenti sia nel DNA plasmidico che cromosomico con diversi ruoli fisiologici. Considerata l’elevata diffusione dei sistemi TA, possiamo ipotizzare che essi svolgano importanti ruoli vantaggiosi per la sopravvivenza delle cellule nel loro habitat naturale. Le tossine possono favorire l’adattamento cellulare in ambienti in continuo cambiamento, rallentando od inibendo la crescita cellulare oppure causando la morte di alcune cellule (Yamaguchi et al., 2011). I sistemi TA sono sistemi che codificano per due geni adiacenti: un gene che codifica per una tossina stabile in grado di uccidere le cellule o di causare arresto della crescita cellulare, e un secondo gene che codifica per un’antitossina instabile che neutralizza l’azione della tossina (Sabine Brantl and Natalie Jahn 2015). Le tossine agiscono interferendo con diverse funzioni cellulari come: la sintesi proteica, la replicazione del DNA e la sintesi della parete cellulare, in risposta a condizioni di crescita sfavorevoli. Attualmente, i sistemi TA sono classificati in 6 tipi a seconda della natura e del meccanismo di azione dell’antitossina (Lobato-Marquez et al., 2016). I sistemi TA di tipo I sono costituti da un’antitossina a RNA non codificante che si lega in modo complementare all’mRNA codificante per la tossina, causando cosi la degradazione del doppio filamento di RNA o l’inibizione del processo di traduzione della tossina (Brielle et al., 2016; Gerdes,K., & Wagner 2007). La maggior parte delle tossine di tipo I sono piccoli peptidi idrofobici capaci di alterare l’integrità della membrana batterica inducendo come conseguenza alterazioni del potenziale di membrana. Nonostante il loro meccanismo di azione possa essere differente, studi strutturali hanno mostrato che tutti i peptidi tossici appartenenti a sistemi TA sono caratterizzati da un dominio transmembrana a α-elica, che è probabilmente in grado di interferire con l’organizzazione della membrana cellulare (Brielle et al., 2016; Brantl, S.; Jahn, N. 2015; Wessner et al., 2015). Recentemente, Folli et al. (2017) hanno identificato per la prima volta un sistema TA di tipo I localizzato sul DNA plasmidico di due ceppi di L. rhamnosus isolati da formaggio. Questo sistema TA comprende due RNA trascritti in modo convergente: l’RNA I che codifica per un peptide di 29 amminoacidi chiamato Lpt che funge da tossina e l’RNA II, un RNA non codificante che svolge il ruolo di antitossina. Sia l’RNA I che l’RNA II contengono una sequenza di 24 nt altamente complementare (DR: direct repeat sequence) che potrebbe essere coinvolta nell’interazione intermolecolare tra mRNA codificante per Lpt e RNAII. Gli RNA della tossina e dell’antitossina sono sovra-espressi in condizioni colturali che mimano l’ambiente del formaggio, suggerendo un loro possibile ruolo in condizioni di carenza nutrizionale. Inoltre, le analisi bioinformatiche hanno dimostrato che regioni omologhe al locus TA Lpt sono ampiamente distribuite su plasmidi presenti in batteri del gruppo L. casei (L. rhamnosus, L. casei and L. paracasei) e in L. brevis, suggerendo una funzione rilevante dei sistemi TA nel genere Lactobacillus. I batteri lattici (LAB) sono coinvolti in processi industriali importanti, come la produzione di formaggio, di pane, di carne e sottoaceti, ma sono anche componenti importanti del microbiota umano; inoltre, alcuni ceppi hanno mostrato attività probiotiche (Giraffa et al.,2010). La composizione della popolazione batterica dei LAB è cruciale per il mantenimento dell’equilibrio richiesto per le loro buone prestazioni. L’attivazione dei sistemi TA potrebbe influenzare la composizione della popolazione batterica e modificare le prestazioni tecnologiche negli alimenti fermentati oppure potrebbe modulare la composizione del microbiota intestinale. Per tutti questi motivi è importante studiare l’attività e la regolazione dei sistemi TA nei batteri lattici e particolarmente in Lactobacillus, il principale genere maggiormente usato nelle applicazioni tecnologiche. In questo progetto è stato studiato il meccanismo di azione della tossina Lpt nell’organismo modello E. coli tramite l’uso di curve di crescita, della microscopia a fluorescenza e della microscopia a forza atomica (AFM). Le cellule trasformate con il vettore di espressione inducibile da lattosio pET11b contenente il DNA codificante per il peptide Lpt predetto è stato usato per i saggi di crescita. L’induzione della sintesi di Lpt mediante IPTG ha causato l’arresto della crescita cellulare e l’analisi mediante microscopia a fluorescenza, usando la colorazione DAPI/Etidio Bromuro, ha evidenziato danni alla membrana e condensazione del nucleoide. Le immagini raccolte mediante microscopia a forza atomica hanno inoltre mostrato alterazione sulla superficie delle cellule di E. coli compatibili con la perdita di porzioni del doppio strato fosfolipidico della membrana esterna. Sono stati condotti anche esperimenti mirati a studiare la localizzazione del peptide Lpt all’interno della cellula batterica. In questi esperimenti, la proteina fluorescente rossa mCherry è stata fusa con l’estremità C-terminale del peptide tossico Lpt. Sulla base della struttura predetta in omologia con Fst, la regione idrofilica carbossiterminale di Lpt è rivolta verso il citosol; il legame di mCherry a questa estremità non dovrebbe quindi interferire con l’eventuale interazione di Lpt con la membrana. Curve di crescita sono state allestite per le cellule di E. coli trasformate con il vettore di espressione pET11b-Lpt-mCherry in presenza ed in assenza d IPTG per valutare la tossicità della proteina fusa. La proteina fusa ha mantenuto la sua capacità di inibire la crescita di E. coli e la microscopia a fluorescenza, usando la colorazione con DAPI, ha rivelato la condensazione del nucleoide. Il segnale di fluorescenza di mCherry si è inoltre localizzato in prossimità della membrana cellulare a seguito dell’espressione della proteina fusa Lpt-mCherry. La tossina Lpt ed i suoi peptidi omologhi contengono un numero di residui amminoacidici che varia tra 29 e 34, un’identità di sequenza che va da 38 a 100% e un residuo di prolina in posizione 11 conservato (Folli et al., 2017). Il peptide Fst presenta anch’esso un residuo di prolina in posizione 11, che risulta cruciale per la sua tossicità (Weaver et al., 2009). Al fine di studiare il ruolo della prolina 11 nella tossicità del peptide Lpt, sono stati eseguiti esperimenti di mutagenesi sito-specifica in cui questo residuo è stato sostituito con un residuo di alanina, valina, o acido glutammico. Inoltre, per valutare l’importanza dell’estremità C-terminale del peptide per l’attività tossica, è stato ottenuto il peptide Lpt troncato, mancante degli ultimi 8 amminoacidi, mediante la sostituzione del residuo di lisina in posizione 22 con un codone di stop. I risultati hanno mostrato che la sostituzione nella tossina Lpt della prolina 11 con residui idrofobici come alanina e valina non influenza la tossicità, mentre la sostituzione con acido glutammico induce la scomparsa della tossicità. Esperimenti di RACE condotti in precedenza per caratterizzare RNAI e RNAII del sistema TA Lpt/RNAII hanno permesso di identificare un trascritto relativo all’RNAI che risulta più corto di quello predetto in silico sulla base della posizione dei promotori, suggerendo la possibilità di un processamento post-trascrizionale dell’RNAI al fine di permetterne la traduzione e la sintesi del peptide Lpt. Il trascritto dell’RNAI sperimentalmente identificato inizia 27 nt a valle del predetto sito di inizio trascrizione e la sua estremità 3’ si trova 8 nt a monte del predetto sito di fine trascrizione (Folli et al., 2017). Il taglio dell’RNAI è stato anche proposto per il sistema TA Fst come meccanismo di attivazione della traduzione (Weaver, 2012), ma la forma processata dell’RNA codificante per Fst non è mai stata sperimentalmente identificata. Per valutare il ruolo della sequenza 5’ dell’RNA I sono stati fatti degli esperimenti di “Band-shift” per studiare l’interazione tra RNAI e RNAII. Tramite la trascrizione in vitro abbiamo ottenuto l’RNAII dell’antitossina e tre diverse molecole di RNAI: “RNAI lungo” predetto tramite analisi bioinformatiche, “RNAI corto” identificato sperimentalmente tramite la tecnica RACE e RNAI troncato privato della sequenza DR, probabilmente responsabile dell’interazione RNAI-RNAII. I risultati di questi esperimenti mostrano come l’antitossina RNAII sia in grado di legare entrambi gli RNAI lungo e corto, con una maggiore affinità per la molecola più corta. Al contrario, l’antitossina è in grado di interagire con la forma troncata dell’RNAI supportando il ruolo della sequenza DR presente nell’RNAI e nel RNAII nell’interazione tra RNAI-RNAII. Per rilevare le forme di RNAI (versione lunga o corta) presenti in L. rhamnosus cresciuto in diverse condizioni, sono stati condotti esperimenti di Northern Blotting. L’RNA totale estratto dal L. rhamnosus cresciuto in terreno completo o in una condizione di carenza nutrizionale in grado di simulare l’ambiente del formaggio è stato analizzato mediante l’impiego di tre sonde: la sonda per l’identificazione dell’RNAI lungo o dell’RNAI privo dell’estremità 5’ (versione corta), la sonda per l’identificazione dell’antitossina RNAII e la sonda per l’identificazione del gene housekeeping rRNA5S. In entrambe le condizioni analizzate, è stato identificato solo l’RNAI privo della sequenza 5’. Questo risultato conferma che la forma corta dell’RNAI è effettivamente presente all’interno delle cellule batteriche e potrebbe rappresentare la forma attiva dell’mRNA codificante per la tossina Lpt.