Chaperoni molecolari e Malattia di Parkinson: Ruolo di Clusterina nel processo di aggregazione di alfa-Sinucleina

Un comune aspetto a molte malattie neurodegenerative è la presenza di inclusioni proteiche, costituite prevalentemente da proteine endogene mal ripiegate. Nella malattia di Parkinson (MP) e nelle altre malattie, note come malattie dei corpi di Lewy (LBD), α-Sinucleina (αSyn) costituisce la principale componente proteica delle inclusioni citoplasmatiche, definite Lewy Body (LB), che caratterizzano queste patologie. αSyn normalmente non presenta una struttura secondaria definita, mentre in condizioni patologiche adotta una conformazione a foglietto-β che si ritiene essere coinvolta o innescare eventi di aggregazione. Numerosi studi sperimentali evidenziano che il processo di aggregazione di αSyn sia un punto chiave nella patogenesi delle LBD e questo sottolinea come il mantenimento dell’omeostasi proteica sia di fondamentale importanza per garantire la corretta funzionalità cellulare. Le cellule presentano diversi sistemi di controllo qualità delle proteine e le Heat Shock Proteins (HSP) ne identificano una delle componenti principali, in quanto stabilizzano parzialmente le proteine unfolded, dissociano gli aggregati proteici o dirigono le proteine misfolded verso i sistemi di degradazione cellulare. Diverse HSP sono state ritrovate nei LB, come anche Clusterina (CLU), una glicoproteina ubiquitaria secreta che evidenzia un’attività simile a quella delle HSP. CLU è identificata come uno chaperone ATP-indipendente extra-cellulare, ma sebbene sia destinata alla secrezione, è stato dimostrato che in condizioni di elevato stress viene favorita la sua ritenzione intracellulare con localizzazione nel citosol ed in altri sub-compartimenti cellulari. È stato, dimostrato che CLU lega alcune proteine misfolded sia nello spazio extracellulare, sia all’interno delle cellule, e le scorta verso altri chaperoni o verso i sistemi proteolitici. Nonostante differenti studi attribuiscano a CLU un ruolo importante nel sistema di controllo della proteostasi cellulare nella malattia di Alzheimer (MA), il ruolo che svolge nella patogenesi della MP, non è ancora stato indagato, sebbene diverse evidenze sperimentali suggeriscano un suo possibile coinvolgimento anche in questa patologia. A tal proposito, lo scopo del progetto è indagare se CLU esercita un ruolo nei meccanismi di difesa cellulare attivati per contrastare gli effetti della sovrespressione di αSyn e la formazione e/o clearance degli aggregati di questa proteina. Lo studio è stato effettuato articolando l’attività sperimentale in modelli di complessità crescente, impiegando colture cellulari per la sperimentazione in vitro, modelli animali per la sperimentazione in vivo (in collaborazione con l’Università di Modena e Reggio Emilia) e includendo anche valutazioni retrospettive molecolari, eseguite presso l’Università di Oxford, su campioni di tessuto cerebrale umano appartenenti a soggetti affetti da LBD. I dati ottenuti con questo lavoro hanno per la prima volta messo in luce un coinvolgimento di CLU nel processo di aggregazione di αSyn. Abbiamo constatato che i livelli di questo chaperone sono up-regolati già in una fase precoce e spesso asintomatica della malattia, come mostrato dalle analisi ex vivo e in modelli cellulari di sovrespressione di αSyn (analisi in vitro). Dalle analisi è emerso, inoltre, che in cellule sovraesprimenti αSyn, prima della formazione di oligomeri ed aggregati insolubili, quando l’attivazione dell’UPR è ancora irrilevante, CLU è l’unico chaperone, tra quelli analizzati (Hsp27, Hsp70 e Hsp90), ad aumentare significativamente la propria espressione, suggerendo un ruolo specifico nel controllo del folding di αSyn. Al fine di verificare il suo ruolo in questo contesto, gli esperimenti di loss-of-function hanno mostrato come il silenziamento di CLU favorisca la formazione di aggregati insolubili di αSyn, anche in assenza di trattamento con MG132, un farmaco utilizzato per bloccare il proteasoma e aggravare lo stress proteotossico, senza modificare significativamente l’UPR, la sopravvivenza cellulare, l’attivazione delle caspasi o determinare un aumento compensativo del livello di espressione di nessuno degli altri chaperoni analizzati. Le prove di co-immunoprecipitazione suggeriscono, inoltre, che CLU interferisca con il processo di aggregazione di αSyn attraverso un’interazione diretta fra le due proteine. Nell’ultima parte di questo lavoro sono stati studiati gli effetti della delezione genica di CLU in un modello murino di MP indotto da neurotossine. I risultati evidenziano che gli animali C57Bl/6CLU-/- (CLU-KO) hanno comportamento locomotorio, attitudine esplorativa e forza muscolare paragonabile rispetto ai fratelli di lettiera che esprimono normali livelli di proteina C57Bl/6CLU+/+ (WT). L’estensione della neurodegenerazione indotta da iniezione unilaterale stereotassica intracranica di rotenone è stata inferiore al 50%, sia in animali WT e CLU-KO, con livelli individuali estremamente variabili, probabilmente correlabili alla scarsa riproducibilità della procedura di iniezione streotassica. Inoltre, la sola iniezione di veicolo ha indotto livelli di neurodegenarazione paragonabili al farmaco negli animali CLU-KO ma non nei WT. Tutto questo ha reso impossibile misurare differenze statisticamente significative negli effetti causati dal trattamento e dal genotipo sulla neurodegenarazione. Non di meno, il fatto che il solo veicolo abbia determinato neurodegenarazione negli animali CLU-KO, unitamente al risultato del test di lateralizzazione, suggerisce un possibile ruolo neuroprotettivo per CLU. Il coinvolgimento di CLU nel processo di aggregazione di αSyn dimostrato in questo lavoro di tesi, rappresenta un punto di partenza per il consolidamento di nuove conoscenze potenzialmente utili allo sviluppo di strategie farmacologiche mirate a contrastare l’alterazione dell’equilibrio della proteostasi, evento precoce e comune delle malattie da misfolding.