Immunohistochemical analysis of structural remodelling and stem cell phenotypes distribution in human diabetic pancreas

I dati epidemiologici evidenziano che l’incidenza del diabete mellito, entro il 2025, raggiungerà il 5,4% della popolazione mondiale adulta e che la maggior parte delle morti sarà attribuibile a patologie cardiovascolari ad esso associato. Il diabete potrebbe rappresentare una condizione di partenza per stabilire se la patologia d’organo sia primitivamente dovuta a modificazioni nelle proprietà funzionali delle cellule staminali, delle cellule parenchimali o di entrambe le popolazioni. La condizione di iperglicemia cronica caratteristica del diabete si associa ad un danneggiamento a lungo termine, disfunzione, fino all’insufficienza multiorgano, attraverso complicanze micro- e macro-vascolari che colpiscono cuore, cervello, vasi sanguigni periferici, retina, reni e sistema nervoso periferico. La variabilità della risposta tissutale all’iperglicemia causata dal diabete rende difficile, però, attribuire una causa univoca dello scompenso multiorgano associato alla malattia. Esiste una letteratura significativa riguardante i difetti funzionali dei progenitori endoteliali sia midollari che circolanti (EPCs), e numerose osservazioni del nostro gruppo hanno documentato la presenza di microangiopatia nel midollo e una alterazione delle nicchie osteoblastiche dovuta ad un difetto del sistema nervoso simpatico nel diabete. L’ipotesi che si vuole dimostrare nel corso di uno studio molto più ampio è che, il diabete, oltre all’insulto metabolico diretto alle cellule parenchimali, possa anche determinare uno scompenso funzionale delle cellule staminali progenitrici residenti e circolanti, tali da portare ad alterazioni dell’omeostasi e disfunzione di organi bersaglio. Poiché in letteratura sono scarsi i dati che descrivono in un organo complesso quale il pancreas, la distribuzione sia di cellule organo-specifiche (alfa e beta cellule) sia di cellule caratterizzanti le nicchie staminali in corso di diabete, ci siamo proposti di studiare morfologicamente e morfometricamente le componenti strutturali dell’organo al fine di descrivere possibili alterazioni indotte dalla malattia. La casistica comprende 35 campioni di pancreas umano di cui 15 provenienti da pazienti normoglicemici e 20 da pazienti con diabete mellito di tipo 2. Dopo aver quantificato la componente fibrotica del tessuto mediante colorazione tricromica di Masson, avvalendoci di tecniche di immunoistochimica, è stato effettuato il riconoscimento di cellule alfa secernenti glucagone e cellule beta secernenti insulina. E’ stata, poi, effettuata una valutazione mediante immunofluorescenza della distribuzione della rete vascolare, riconoscendo i profili positivi ad actina muscolare liscia (arterie), CD34 (venule e capillari) e D2-40/podoplanina (vasi linfatici). Mediante tecniche di immunofluorescenza abbiamo identificato la presenza e la localizzazione di cellule che presentassero fenotipi di staminalità adulta (c-kit, CD133, CD34 e CD44) in assenza di altri marcatori di differenziazione. Dal momento che i mastociti esprimono alti livelli di c-kit abbiamo effettuato una doppia colorazione per Tryptase. Infine, su un numero limitato di campioni di pancreas ottenuti da pancreasectomia, abbiamo isolato e caratterizzato le cellule endoteliali e le abbiamo testate sottoponendole a diverse concentrazioni di glucosio, paragonandole alle cellule HUVEC, cellule usate come controllo nello studio di popolazioni endoteliali. La prima valutazione, volta alla descrizione della distribuzione delle varie componenti strutturali ha evidenziato che circa il 60% del pancreas è occupato dal tessuto parenchima funzionale (esocrino ed endocrino), 18% da fibrosi mentre per il 22% da stroma vascolare; percentuali che si modificano in presenza di diabete con una riduzione della componente funzionale ed un aumento della deposizione di collagene, soprattutto di tipo interstiziale e perivascolare. Per quanto riguarda la porzione endocrina, nel diabete le isole risultano essere di minore dimensione e con una interessante riduzione sia di cellule positive per insulina sia di quelle positive per glucagone. Contrariamente, è stata ritrovata una popolazione di cellule singole positive per i due marcatori distribuite nel parenchima pancreatico che, invece, è risultata arricchita nei pazienti con diabete. La valutazione della rete vascolare documenta una riduzione della densità venulare e capillare nelle sole isole di Langerhans diabetiche mentre la densità di arteriole -SMApos è ridotta nel parenchima, ma con un aumento dello spessore della parete arteriolare nei soggetti diabetici. Tuttavia, la riduzione del parenchima funzionale, come conseguenza del diabete mellito, tende a depletare il rapporto vasi /cellule in confronto con il parenchima di controllo. Anche per i vasi linfatici si documenta un trend di riduzione nei campioni con presenza di patologia diabetica. Si è quindi proceduto al riconoscimento delle cellule progenitrici, costituite da una popolazione di cellule positive per c-kit, recettore di stem cell factor. Queste cellule c-kitpos rappresentano lo 0,058±0,015% della popolazione totale nei pancreas normoglicemici, risultando prevalentemente (>50%) localizzate all’interno degli isolotti; nei campioni diabetici, invece, la percentuale si riduce drasticamente e in maniera più evidente nel parenchima pancreatico. Il fenotipo staminale CD133 mostra invece un andamento opposto, con un incremento anche se non significativo nei campioni patologici. È interessante notare che le cellule progenitrici positive per CD34 sono risultate significativamente ridotte (p<0,05) nei pancreas dei pazienti diabetici confrontati con i controlli normoglicemici. Per quanto riguarda lo studio in vitro, una volta isolate le cellule endoteliali dai pezzi a fresco di pancreas umano, è stata condotta un’analisi funzionale sul comportamento di queste cellule in condizioni di iperglicemia, volte a mimare il microambiente diabetico. Inaspettatamente, il saggio di vitalità effettuato a 12 e 72ore ha mostrato un aumento della proliferazione delle cellule endoteliali pancreatiche (PanEC) nel medium condizionato con i più alti livelli di glucosio (22mM) mentre le HUVEC risentono dell’effetto tossico dell’iperglicemia. I saggi di Wound Healing e angiogenesi su matrigel hanno mostrato un rallentamento della migrazione e della tubulogenesi nella nostra popolazione di interesse (PanEC) in tenore di alto glucosio. Questo studio offre le basi per indagini successive volte a comprendere l’impatto del diabete mellito sul riarrangiamento strutturale e sul possibile coinvolgimento di cellule progenitrici nei meccanismi di disregolazione dell’omeostasi tissutale e funzionale. Pur non avendo stabilito se queste modificazioni siano una causa o una conseguenza del danneggiamento multiorgano tipico del diabete, il nostro approccio potrebbe offrire nuovi spunti nella comprensione della angiopatia diabetica tessuto-specifica.