Studio longitudinale mediante FISH e significato prognostico dell'eterogeneità genetica intratumorale nella Leucemia Linfatica Cronica

Background: La leucemia linfatica cronica (LLC) è la leucemia più diffusa nel mondo occidentale ed è caratterizzata da una estrema eterogeneità clinico-biologica. Alla luce di questa straordinaria eterogeneità, diversi gruppi di studi si sono focalizzati nell’individuare il miglior algoritmo prognostico per la stratificazione dei pazienti. Fino ad ora, nessuno dei modelli proposti è stato universalmente adottato. Sebbene siano stati individuati un gran numero di indici prognostici, le quattro anomalie citogenetiche ricorrenti rilevate dall'ibridazione in situ fluorescente (FISH) sono ancor’oggi considerate i più potenti marker prognostici (in ordine decrescente di avversità: del (17p), del (11q), trisomia 12, no aberrazioni, del (13q)). La classificazione gerarchica di Dohner, basata su queste quattro anomalie, sviluppata più di 15 anni fa, è ancora ampiamente utilizzata nella routine clinica. Tuttavia, la prognosi di ciascun gruppo di rischio citogenetico corrente rimane eterogenea. L’eterogeneità genetica intratumorale (ITH), ovvero la coesistenza di multipli subcloni, potrebbe essere responsabile di questa non uniformità. Inoltre, le tecniche di genome wide hanno identificato anomalie citogenetiche addizionali con rilevanza clinica-patologica. Gli attuali approcci diagnostici, FISH e Citogenetica Convenzionale (CC), potrebbero sottostimare la complessità di LLC. Il primo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di confrontare il tasso di anomalie rilevate dalle tecniche utilizzate nella routine clinica con metodi citogenetici più sofisticati, ovvero Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA), array comparative genomic hybridization + Single Nucleotide Polymorphism arrays (aCGH+SNP array) ed una nuova tecnica di cariotipizzazione basat sulla tecnologia Next Generation Sequencing. Il fine ultimo è stato quello di individuare l'approccio metodologico migliore, che possa superare i limiti della FISH (tecnica targeted) e della CC (bassa risoluzione). Il secondo scopo del lavoro è stata la validazione di un recente algoritmo prognostico che integra il numero e la simultanea presenza delle anomalie citogenetiche ricorrenti e la dimensione dei subcloni genetici intratumorali. Inoltre, abbiamo anche eseguito uno studio longitudinale per 52 pazienti, eseguito a tre diversi time-point, ovvero alla diagnosi, pre-terapia e al follow-up, per valutare l'evoluzione clonale in relazione alla terapia e al decorso della malattia. Materiali e Metodi: Per il primo scopo, eseguito in collaborazione con il Centro di genetica umana dell'ospedale di Leuven (BE), l’analisi di citogenetica convenzionale mediante R-bandong e di FISH è stata eseguita su 10 pazienti. Sono state testate le seguenti sonde: (LSI RB1 (SG) / D13S319 (SO), XL DLEU / LAMP / 12CEN e XL ATM / TP53 (cut-off: 5%). Inoltre i campioni sono stati analizzati mediante: MLPA, utilizzando il SALSA MLPA P038-A2 CLL kit (MRC-Holland), la piattaforma CytoSure Haematological Cancer + SNP Array (8x60k) ed attraverso una nuova metodica di cariotipizzazione molecolare basata sulla tecnologia NGS che consente un sequenziamento multiplex (sequenziamento in parallelo di 14-18 campioni) a bassa copertura (coverage 0.17x e ~ 12x106 per campione) ma ad alta risoluzione. Successivamente, per convalidare il nuovo algoritmo abbiamo analizzato 105 pazienti mai trattati con un follow-up medio di 69 mesi. E’ stata eseguita l’analisi di citogenetica convenzionale mediante Q-banding per 58 pazienti alla diagnosi e per 19 pazienti al follow up. L’analisi FISH è stata eseguita su tutta la casistica, usando il pannello di sonde LLC standard: XL DLEU / LAMP / 12CEN e XL ATM / TP53. Abbiamo distinto un major clone ed un minor clone, se la differenza tra 2 anomalie presenti in un stesso paziente era> 30%. I pazienti sono stati quindi stratificati nei tre gruppi di rischio (favorevole, neutro, avverso) sulla base sia dell’ attuale che del nuovo modello prognostico. La sopravvivenza globale (OS) ed il tempo al primo trattamento (TTFT) sono stati valutati con il metodo di Kaplan Maier e le caratteristiche prognostiche sono state analizzate mediante test log-rank (p <0,05). Risultati Progetto 1: Dalla combinazione di tutte le tecniche, escluso il cariotipo, è stato rilevato un totale di 28 copy number variation (CNV). E’ stato dimostrato che l'analisi FISH sottostima la complessità genomica della LLC. La MLPA non è risultata un valido strumento da introdurre nella pratica clinica, a causa della sua bassa sensibilità. L'analisi genome wide, eseguita mediante aCGH + SNP array e mediante la tecnica di cariotipizzazione basata sulla tecnologia NGS, ha mostrato il più alto tasso di rilevamento delle anomalie, individuando anche lesioni genomiche addizionali (39%), con una buona concordanza statistica con l’analisi FISH. La tecnica di NGS rispetto agli aCGH + SNP è risultata vantaggiosa sia in termini economi ma soprattutto perché caratterizzata da una più alta sensibilità. Tuttavia, questo promettente approccio non consente di rilevare, la copy neutral loss of heterozygosity (CN-LOH), una nuova anomalia con un probabile impatto prognostico. La combinazione di aCGH e SNP array in un unico esperimento è l'unico approccio per il rilevamento di CN-LOH. Nella nostra coorte, sono stati rilevati due casi con CN-LOH in 11q14.3q22.3 e 20q11.21q14. Risultati Progetto 2: Alla diagnosi, l'analisi Q-banding ha mostrato nel 37% dei casi cariotipo anomalo (19/51), il 31% (6/11) dei quali con cariotipo complesso (CK) (≥ 3 anomalie). Durante il follow up, l'analisi Q-banding è stata eseguita in 19 pazienti: 58% (11/19) con cariotipo anormale e sei dei quali con CK. Nell'87% dei pazienti è stata rilevata almeno un'anomalia in FISH: una singola anomalia in 40 (46%) pazienti, due anomalie in 33 (38%), tre anomalie in 12 (14%) e quattro anomalie in 2 (1,9% ) pazienti. Sulla base di questi dati, in combinazione con la dimensione del clone, i pazienti sono stati stratificati nei tre gruppi di rischio: favorevole, intermedio e sfavorevole sia dell’attuale che del nuovo modello prognostico. Il 12% di pazienti è stato ristratificato. Sorprendentemente, è stata osservata una differenza statisticamente significativa nell'OS (p <0,05) tra i tre gruppi di rischio solo adottando il nuovo modello. Inoltre, l’approfondita analisi di composizione clonale mediante FISH ci ha permesso di discriminare tra i pazienti monoclonale (47%) e ITH (17%) e di definire differenti dinamiche clonali: riduzione/eradicazione clonale, stabilità clonale, equilibrio clonale, squilibrio clonale. Lo studio longitudinale ha mostrato nel 25% dei pazienti evoluzione clonale (CE). Le anomali più frequente acquisite nel follow up erano la del(17p) e la monosomia 12. Sebbene il CE fosse maggiormente associata a progressione clinica, è stata rinvenuta anche in pazienti non trattati e con stabilità clinica. Inoltre, è emerso che nei pazienti con ITH la terapia, in particolare l'esposizione alla chemioterapia, può distruggere l'equilibrio clonale stabilitosi tra i diversi cloni, promuovendo la selezione e l'espansione del clone fitter. Nel nostro studio, non vi era alcuna associazione tra presenza di anomalie citogenetiche rinvenute alla diagnosi e CE. Infine, i pazienti con evoluzione clonale hanno mostrato un breve TTFT ma con OS paragonabile ai pazienti senza CE. Conclusioni: Il nostro studio ha rivelato che la tecnica di cariotipizzazione NGS-based potrebbe essere associata alle attuali tecniche diagnostiche. Tuttavia l'analisi FISH, sia per l’alta sensibilità ma soprattutto perché è una metodoca che consente l’analisi su singola cellula consentendo l’individuazione di subcloni emergenti, rimane un potente strumento nel setting clinico dei pazienti con LLC. Inoltre, poiché il significato prognostico delle nuove anomalie cromosomiche non è stato chiaramente definito ad oggi la FISH e la CC non possono essere completamente sostituiti nella diagnosi e nella stratificazione di pazienti con LLC. Sono necessari ulteriori studi per stabilire i criteri standard per la futura applicabilità clinica della nuova e promettente metodica di cariotipizzazione molecolare. Inoltre, abbiamo confermato che il CK rilevato da Q-banding è un indicatore di prognosi sfavorevole. Abbiamo dimostrato che anomalie citogenetiche ad alto rischio se presenti come minor clone mostrano un decorso clinico favorevole. Il nuovo algoritmo di stratificazione, che include il fenomeno dell’ ITH, è più efficace nel predire la sopravvivenza e il TTFT nei pazienti con LLC rispetto all’algoritmo convenzionale. Infine, lo studio longitudinale ha mostrato che la CE è un evento frequente nei pazienti con LLC. Inoltre, l'esposizione alla chemioterapia sembra essere responsabile di una marcata evoluzione clonale. I nostri risultati evidenziano la necessità di analisi FISH sequenziali anche nei pazienti con LLC mai trattati dato che l'insorgenza di clone con del(17p) è stata rinvenuta anche in assenza di trattamento. Sono necessari ulteriori studi longitudinali per definire l'associazione tra dinamiche clonali e decorso clinico, per definire le traiettorie evolutive e per far luce sugli eventi genetici che possono verificarsi nel corso della malattia e che possono spiegare resistenza al trattamento ed una breve sopravvivenza. In conclusione, la ricerca di ITH alla diagnosi e/o al momento del primo trattamento potrebbe predire l'evoluzione clonale e la generazione di subcloni resistenti alla terapia.