L’infezione da citomegalovirus umano in particolari categorie di soggetti: possibili fattori di virulenza e risposte dell’ospite

Le indagini svolte nel corso dei tre anni di Dottorato di Ricerca sono state rivolte allo studio di citomegalovirus umano (HCMV) e dei possibili fattori di virulenza e meccanismi molecolari che tale agente è in grado di mettere in atto e che lo rendono, in specifiche situazioni, di rilevante interesse medico. Come gli altri membri della famiglia Herpesviridae, HCMV dopo l’infezione primaria persiste come virus latente, condizione da cui può estemporaneamente riattivarsi in maniera inapparente o, al contrario, con gravi conseguenze in categorie di individui con alterazioni della risposta immunitaria, a rischio di sviluppare patologie gravi e non di rado mortali. Sulla base di tali premesse, i meccanismi che favoriscono la transizione dalla latenza alla riattivazione virale sono di particolare rilevanza ed il loro studio impegna, ancora oggi, numerosi gruppi di ricerca, non senza difficoltà. Infatti, è noto come le principali sedi di latenza di HCMV siano rappresentate dai monociti del sangue periferico e dai loro progenitori CD34+ del midollo osseo e che il differenziamento dei monociti a macrofagi in vivo costituisca un evento chiave legato alla riattivazione del virus. D’altra parte, gli studi ex vivo sono fortemente ostacolati dal fatto che il numero di cellule infettate e la quantità di DNA di HCMV reperibile nelle sedi naturali di latenza sono estremamente esigue. In tale contesto, nel corso del primo anno di Dottorato, utilizzando una linea monocitaria/macrofagica umana (cellule THP-1), è stato messo a punto e validato un modello di infezione in vitro per lo studio della riattivazione di HCMV che, ricalcando quanto avviene in vivo, permettesse, al contempo, di fruire di un numero adeguato di cellule infettate rispetto al sistema naturale. L’esperienza acquisita in tale ambito, così come nella ricerca di marcatori di virulenza di HCMV che differenziano i ceppi virali circolanti in natura, ha anche reso possibile il coinvolgimento attivo del gruppo di ricerca di Virologia dell’Università di Parma nel Programma Regione-Università (2014-2016) ammesso a finanziamento, dal titolo: “A tailored approach to the immune-monitoring and clinical management of viral and autoimmune diseases” (“Workpackage 4”: “HCMV infection in the elderly”). Tale progetto è focalizzato sulla Medicina personalizzata e sulla correlata ricerca di marcatori prognostici di differenti quadri patologici; in particolare, al nostro gruppo di ricerca, in collaborazione con un secondo gruppo, è stato affidato lo studio sul ruolo di HCMV in soggetti anziani con ictus ischemico. In tale categoria di individui, rappresentata da soggetti adulti per la quasi totalità positivi per anticorpi anti-HCMV, la riattivazione del virus endogeno rappresenta un evento temibile. In particolare, è stato evidenziato come, nei soggetti anziani, il mantenimento dell’equilibrio fra infezione latente da HCMV e risposta immunitaria antivirale comporti l’espansione di quest’ultima ed un riassetto del sistema immunitario; a tale riguardo, è stata dimostrata una correlazione tra il deterioramento delle condizioni di salute degli anziani e l’aumento in termini quantitativi della risposta immunitaria anti-HCMV. L’ipotesi emergente è che, sottesi a questo evento, vi possano essere episodi di riattivazione virale sistemica o localizzata. In tale contesto, nel corso del secondo anno di Dottorato lo studio è stato focalizzato sugli aspetti sopra menzionati, prendendo in considerazione una coorte di soggetti anziani con ictus ischemico ricoverati presso l’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma. In primo luogo, è stato verificato lo stato immunitario di questi pazienti nei confronti di HCMV ed è stata effettuata la ricerca del DNA di HCMV dal plasma degli stessi per la determinazione della viremia (possibile riattivazione di HCMV). I risultati emersi dalla determinazione degli anticorpi anti-HCMV, che hanno indicato una sieroprevalenza del 93%, sono in accordo con il fatto che la maggior parte degli individui contrae l’infezione primaria da HCMV durante l’infanzia o l'età adulta. Di conseguenza, come atteso, la quasi totalità dei soggetti inclusi in questo studio sono risultati potenzialmente a rischio di riattivazione virale. Per quanto riguarda la viremia, il basso numero di copie di DNA di HCMV, rilevato nell’11.7% dei pazienti sieropositivi per HCMV, suggerisce che in questa categoria di pazienti il virus possa sfuggire alla sorveglianza immunologica ed alternare stati di latenza con stati di replicazione, verosimilmente associata ad episodi di riattivazione virale localizzata. Parallelamente, le competenze acquisite dallo studio svolto durante il primo anno di Dottorato (messa a punto di un sistema sperimentale di riattivazione virale) sono state applicate per conseguire il differenziamento dei monociti a macrofagi, ottenuti a partire dai campioni ematici dei soggetti con ictus ischemico considerati nello studio, al fine di agevolare il possibile rilevamento del DNA di HCMV anche allo stato latente. Tale fase si è rivelata di notevole utilità per permettere la successiva attuazione di indagini molecolari volte ad individuare differenti genotipi di HCMV relativi a specifiche glicoproteine del pericapside virale. Queste ultime sono prodotti di geni polimorfici e sono considerate potenziali marcatori di differenti gradi di virulenza dei ceppi virali circolanti. Attraverso amplificazione di specifici frammenti genici del DNA di HCMV e digestione con enzimi di restrizione, è stata effettuata l’identificazione delle diverse combinazioni genotipiche nell’ambito dei geni di HCMV che codificano per le glicoproteine N e O del pericapside virale, quali riconosciuti fattori di virulenza. I risultati ottenuti suggeriscono che gN3-gO1 e gN3-gO2 potrebbero essere le combinazioni genotipiche ricorrenti associate ad una positività per DNAemia virale in questa categoria di soggetti. Nel corso del terzo anno di Dottorato, lo studio su HCMV è stato focalizzato su un’altra categoria di soggetti “a rischio”, considerati nell’ambito di un Progetto di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) 2015, ammesso a finanziamento, dal titolo: “Impatto dell’infezione da virus a DNA sullo sviluppo di patologie autoimmuni: focus sulla sclerosi sistemica”, che ha attivamente coinvolto il gruppo di ricerca di Virologia dell’Università di Parma. A tale riguardo, HCMV è stato recentemente messo in relazione anche all’insorgenza di patologie autoimmuni ed è stato indicato, in particolare, tra i possibili fattori scatenanti la sclerosi sistemica (SSc), una malattia caratterizzata da danno endoteliale, fibrosi di cute ed organi interni ed anomalie immunitarie, sia umorali, sia cellulari. L’eziopatogenesi di tale malattia resta sconosciuta ed è verosimilmente multifattoriale; come per altre condizioni autoimmuni, si ipotizza il ruolo di fattori scatenanti tossici e/o infettivi su un “background” genetico predisponente, nell’ambito di un complesso processo “multi-step”. Costituiscono ipotetici fattori scatenanti la SSc alcuni virus, accomunati dalla capacità di instaurare infezione latente/cronica e di infettare le tipologie cellulari coinvolte nella patogenesi della malattia, quali HCMV. L’esigenza dell’approfondimento di queste ricerche, volte ad appurare il ruolo patogenetico di HCMV nella SSc, è dettata da una serie di dati emersi da diversi studi. In particolare, è stato evidenziato un ruolo rilevante delle risposte linfocitarie T nella patogenesi della SSc, con possibile contributo delle stesse alla modulazione della fibrosi e al danno vascolare, anche se, ad oggi, la tipologia e la funzione di queste specifiche sottopopolazioni di linfociti T non sono ancora state caratterizzate in relazione alle diverse fasi della patologia. In particolare, i linfociti T CD8+ identificati nel sangue periferico di pazienti con SSc presentano un'espansione oligoclonale antigene-dipendente, la cui specificità tuttavia non è ancora nota. HCMV è stato descritto come uno degli agenti in grado di contribuire all'espansione di specifiche sottopopolazioni di linfociti T CD8+ con fenotipo della memoria ed effettore in relazione all’aumentare dell'età (fenomeno noto come “memory inflation”). Sulla base di queste considerazioni, è stato effettuato uno studio relativo al ruolo dell’infezione da HCMV in soggetti affetti da SSc, focalizzando l’attenzione sulla risposta immunitaria cellulo-mediata. Nello specifico, gli obiettivi dello studio hanno riguardato: (i) la valutazione quantitativa delle risposte dei linfociti T CD4+ e T CD8+ in seguito a stimolazione con antigeni immunodominati di HCMV (in particolare pp65, IE1 e UL94) nei soggetti affetti da SSc a confronto con soggetti sani, (ii) la valutazione delle possibili differenze tra le risposte linfocitarie T CD4+ e le risposte linfocitarie T CD8+ HCMV-specifiche nei pazienti affetti da SSc e (iii) la valutazione delle possibili differenze delle risposte linfocitarie HCMV-specifiche in relazione alla durata della malattia e ai principali segni clinici riscontrati nei pazienti. A seguito dell’analisi statistica, applicata al fine di valutare la significatività delle differenze riscontrate, le risposte linfocitarie T CD8+ HCMV-specifiche sono risultate: (i) significativamente più elevate nei pazienti affetti da SSc rispetto ai soggetti sani, (ii) significativamente più elevate rispetto alle risposte linfocitarie T CD4+ HCMV-specifiche nei pazienti e (iii) connesse ad una maggiore durata della malattia e ad un peggioramento del modified Rodnan skin score (metodo standardizzato e validato per la valutazione della gravità della malattia in relazione all'entità della fibrosi in questi pazienti). I risultati ottenuti in questo studio rinforzano l’ipotesi di un coinvolgimento di HCMV nella patogenesi di questa malattia autoimmune. In particolare, cicli di riattivazione di HCMV più frequenti nei pazienti affetti da SSc potrebbero spiegare l'incremento dei linfociti T CD8+ HCMV-specifici con fenotipo di memoria ed effettore; questo potrebbe contribuire all’aggravamento dei processi infiammatori caratteristici della SSc.