Calix[4]arene Derivatives as Artificial Phospodiesterases and Ligands for Proteins

Questo lavoro di tesi è stato incentrato sulla sintesi di nuovi derivati calix[4]arenici e sullo studio del loro utilizzo come catalizzatori supramolecolari e come leganti per proteine. Lo scaffold calix[4]arenico, in conformazione a cono, è stato spesso descritto come una piattaforma adatta allo sviluppo di efficienti fosfodiesterasi artificiali, in seguito alla funzionalizzazione del suo bordo superiore con gruppi guanidinio o unità leganti contenenti ioni metallici. Tuttavia, la possibilità di sfruttare la cooperazione tra diversi tipi di unità catalitiche presenti sullo stesso scaffold macrociclico per il cleavage di legami fosfodiesterei non era stata valutata prima di questo lavoro di tesi. Sono stati quindi sintetizzati due nuovi derivati calix[4]arenici, funzionalizzati al bordo superiore in posizione 1,3 distale o 1,2-vicinale con un gruppo guanidinio e una unità di triazaciclononano come legante per ioni Zn(II) o Cu(II). Dopo la sintesi la purificazione e la caratterizzazione di questi composti, sono stati eseguiti dettagliati studi cinetici dell’attività catalitica dei complessi metallici corrispondenti. I complessi di Cu(II) di entrambi i catalizzatori hanno dato origine a consistenti accelerazioni della scissione del 2-idrossipropil-p-nitrofenilfosfato (HPNP) e del bis-p-nitrofenilfosfato (BNPP), che possono essere considerati rispettivamente composti modello dell’RNA e del DNA, registrando aumenti della velocità del processo in oggetto di 5-6 ordini di grandezza rispetto alla reazione di background. Gli stessi catalizzatori contenenti Cu(II) sono stati testati anche nella scissione di alcuni diribonucleosidi monofosfato, mostrando una notevole attività come fosfodiestasi, con accelerazioni delle velocità di reazione fino a 107-volte rispetto al background. La combinazione dei dati raccolti dalle indagini cinetiche e potenziometriche suggerisce un meccanismo di reazione in cui i catalizzatori in oggetto sfruttino l’azione come base generica o di attacco nucleofilo da parte di uno ione idrossido legato al centro metallico. Determinante sembra anche la stabilizzazione fornita dalle interazioni elettrostatiche tra l’unità di guanidinio e le cariche negative del fosforano presente nello stato di transizione. Con l’obiettivo di mimare la triade catalitica presente nel sito attivo dell’enzima umano Topoisomerasi I, costituita da un residuo di tirosina e da due di arginina, è stato sintetizzato anche un terzo modello di fosfodiesterasi basato su calix[4]areni, tramite funzionalizzazione del bordo superiore con un idrossile fenolico e due unità di guanidinio adiacenti. La forma bis-protonata di questo composto è stata testata nella scissione di un composto modello del DNA, il BNPP (bis-p-nitrofenilfosfato), promuovendo il rilascio di p-nitrofenolo dal substrato 6.5∙104-volte più velocemente rispetto al processo idrolitico di background. I dati sperimentali indicavano che le tre unità catalitiche cooperano in una sequenza di reazioni che comprende un trasferimento di fosforile dal BNPP al fenolato nucleofilo del derivato calix[4]arenico, seguito da un ulteriore rilascio di p-nitrofenolo dell’intermedio fosforilato, che avviene grazie all’attivazione elettrofila da parte della coppia guanidina/guanidinio adiacente. Alla fine del processo, il calix[4]arene fosforilato che ne risultava appare inerte verso la defosforilazione e non presenta turnover. Il derivato trifunzionale bisguanidinio-fenolo di partenza dovrebbe essere di conseguenza descritto come un promotore piuttosto che come un catalizzatore. Lo scaffold calix[4]arenico può essere anche utilizzato per creare leganti in grado di riconoscere la superficie di proteine e di influenzarne le proprietà fisico-chimiche o l’attività biologica. Con questi intenti, alcuni derivati calix[4]arenici sono stati testati come leganti per diverse proteine modello durante un periodo di cinque mesi passato alla National University of Ireland di Galway, sotto la supervisione del Dr. Peter Crowley. La prima coppia proteina legante ad essere stata studiata era composta dal citocromo c (cyt c) e un calix[4]arene che portava al bordo superiore quattro residui di alanina C-terminali. Questi residui, carichi negativamente, si presupponeva potessero fungere da unità leganti adatte alle superficie della proteina, carica positivamente a pH neutro. Titolazioni 15N-HSCQC NMR hanno evidenziato che il legante è in grado di riconoscere diverse catene laterali di lisina sulle superfici proteiche (ovvero la Lys4 e una tra le due Lys87 e Lys89 prossimali), in accordo con quanto riportato per altri calix[4]areni carichi negativamente. Il fitting delle perturbazioni di chemical shift (CSP) delle risonanze ammidiche all’aumentare della concentrazione di legante hanno permesso di dimostrare la presenza di almeno due siti di legame sulle superfici proteiche, con valori per le corrispondenti costanti di dissociazione (Kd) pari a of 0.4 mM e 1.2 mM, rispettivamente, per i due siti di legame. Tentativi di ottenere informazioni termodinamiche e strutturali più dettagliate su questo fenomeno di riconoscimento attraverso esperimenti ITC o di co-cristallizzazione non hanno avuto successo, dato che dalle indagini calorimetriche sono stati ricavati calori di reazione trascurabili, mentre negli studi di co-cristallizzazione è stata osservata solo la gelificazione della proteina in presenza del legante. Un secondo sistema studiato è stato quello del dominio di legame B1 della proteina G streptococcica (GB 1) con una piccola libreria di diversi tetraguanidino calix[4]areni. L’interazione proteina-ligando è stata studiata con esperimenti ITC, con l’obiettivo di estrarre dati aggiuntivi per supportare quelli ottenuti con titolazioni NMR in un lavoro precedente. Nelle condizioni testate, sono stati ottenuti dati trattabili solo iniettando una soluzione di GB 1 in una soluzione contenente un calix[4]arene funzionalizzato al bordo inferiore con quattro gruppi 3-guanidiniopropossido. La Kd, determinata via ITC (8.9 M) come parametro di fitting della isoterma, è risultata leggermente inferiore a quella stimata in precedenza via NMR (80 M), mentre la stechiometria di legame (n= 0.85) suggeriva la coesistenza in soluzione di complessi proteina-legante 1:1 e 1:2. L’analisi dei differenti contributi all’energia libera di legame totale ha evidenziato che il termine entropico e quello entalpico sono entrambi favorevoli per l’evento di riconoscimento studiato e di entità simile, indicando quindi che interazioni sia elettrostatiche che idrofobiche sono importanti perché il processo di legame possa avvenire. Prendendo in considerazione anche i risultati delle titolazioni NMR, è stato quindi proposto che le interazioni elettrostatiche coinvolgano i pendagli guanidinici al bordo inferiore del macrociclo e i residui amminoacidici carichi negativamente (per esempio Asp36, Glu15 and Glu42) sulle superfici proteiche, mentre interazioni idrofobiche, C-H/π o catione/π possano aver luogo tra il backbone del calix[4]arene e i residui amminoacidici aromatici/neutri (Thr18, Phe30, Gly14) o catene laterali cariche positivamente (Lys13).