Dinamica e regolazione allosterica dell'enzima umano serina racemasi

La serina racemasi umana (hSR) è un enzima piridossal 5’-fosfato (PLP) dipendente che catalizza la racemizzazione reversibile dell’L-serina a D-serina e la β-eliminazione dell’L/D-serina a piruvato e ammoniaca nel cervello dei mammiferi. La D-serina è il principale co-agonista dei recettori N-metil-D-aspartato (NMDA) e hSR potrebbe essere un target alternativo per controllare la concentrazione di questo amminoacido nel cervello. Lo scopo di questo lavoro è stato di studiare la dinamica di hSR con particolare attenzione per la regolazione allosterica da parte dell’ATP. Sono stati utilizzati due approcci: lo studio delle variazioni conformazionali indotte da ligandi tramite proteolisi limitata e la caratterizzazione del ruolo di alcuni residui amminoacidici nella comunicazione allosterica tra sito attivo e sito di legame dell’ATP. Nel primo caso è stato messo a punto uno studio di proteolisi limitata utilizzando tripsina. La cinetica di digestione della proteina è stata caratterizzata in assenza di ligandi, in presenza degli attivatori CaCl2, MgCl2, AMP-PCP (un analogo stabile dell’ATP) e degli inibitori malonato, glicina e NADH e analoghi strutturali. I polipeptidi ottenuti sono stati separati tramite SDS-PAGE e in alcuni analizzati mediante spettrometria di massa. L’addizione di CaCl2 o MgCl2 ha stabilizzato la proteina, mentre l’aggiunta di AMP-PCP non ha portato cambiamenti nel pattern di proteolisi. Questo risultato è in accordo con il dato cristallografico di SR di lievito in complesso con AMP-PCP che dimostra l’assenza di variazioni conformazionali in seguito a legame con il nucleotide. Il pattern di proteolisi limitata cambia invece quando l’AMP-PCP è addizionato insieme ad un ligando del sito attivo, come il malonato. L’analisi dei frammenti di proteolisi mediante spettrometria di massa ha permesso di identificare una regione della proteina, composta da una porzione del dominio maggiore e dall’intero dominio minore, che viene stabilizzata in presenza dei due ligandi. Questo risultato suggerisce che è stata isolata una conformazione di hSR in complesso con l’ATP e un ligando, rilevante per indagare i dettagli molecolari della regolazione allosterica dell’enzima. L’indagine sulla comunicazione allosterica tra sito attivo e sito dell’ATP è stata ulteriormente affrontata attraverso uno studio filogenetico combinato alla mutagenesi sito-specifica. Dall’analisi della struttura di SR di lievito in complesso con l’AMP-PCP, è stato identificato un network di legami a idrogeno, formato da cinque amminoacidi M53, N84, Q87, E281, N311 e molecole d’acqua, che connette il PLP e l’ATP. Questo collegamento potrebbe essere importante per la regolazione della struttura del sito attivo in presenza del ligando, che risulta nella stimolazione dell’attività di -eliminazione. Dal confronto di diverse sequenze di SR è stato osservato che si ha Q87 (89 in hSR) in quasi tutte e una A in SR di pianta, la cui attività non è regolata da nucleotidi. La Q è conservata in omologhi strutturali di SR la cui attività è regolata da nucleotide, quali le treonine deaminasi, ma non in serine deidratasi (SDH) che non sono controllate da nucleotidi e presentano una M. Per chiarire il ruolo di questo residuo il mutante Q89M è stato purificato e caratterizzato. In seguito a mutazione è stata osservata una quasi completa perdita della stimolazione dell’attività di β-eliminazione dell’L-Ser da parte dell’ATP. In Q89M-hSR il legame dell’ATP non è cooperativo come osservato per la proteina wt e l’affinità di legame è simile a quella misurata sulla conformazione ad alta affinità di hSR. La mutazione inoltre abolisce il cross-talk tra i siti attivo e allosterico, come dimostrato dagli effetti trascurabili del legame della glicina sull’affinità per l’ATP. Nel complesso questi dati hanno dimostrato che Q89 è un residuo chiave nella comunicazione allosterica tra il sito attivo e il sito di legame dell’ATP in hSR.