Immunosensore amperometrico competitivo per la determinazione di p53 in urina: metodo di screening rapido e non invasivo per la diagnosi precoce del carcinoma della vescica

La proteina p53, è il soppressore tumorale più studiato e conosciuto ed è un fondamentale fattore trascrizionale, la cui azione viene modulata in risposta a diversi stimoli genetici e ambientali. Essa rappresenta un’importante difesa contro lo sviluppo del cancro e la sua progressione, agendo come un “guardiano del genoma”. Studi clinici hanno evidenziato che lo sviluppo del Carcinoma a cellule transizionali della vescica (BTCC) può determinare una significativa sovra espressione di p53 nell’urina, a causa dell’elevata superficie di contatto tra i tessuti epiteliali cancerosi e tale fluido biologico. Pertanto il dosaggio di questa proteina è considerato un valido strumento di screening per stabilire la presenza della malattia e il suo stadio di sviluppo. Ad oggi le tecniche diagnostiche utilizzate per la sua determinazione, richiedono tempi lunghi di esecuzione e costi elevati. Una soluzione è rappresentata dai biosensori, ovvero dispositivi piccoli, economici, portatili, di facile utilizzo e che permettono di ottenere misure rapide e quantitative. L’obiettivo del progetto di ricerca è stato, perciò, lo sviluppo e messa a punto di un sistema diagnostico, basato su tecnologia biosensoristica, per la determinazione della proteina p53, come prova clinica di cancro alla vescica. Più precisamente, abbiamo deciso di sviluppare un “immunosensore”, ovvero la trasposizione sensoristica dei saggi immunoenzimatici. A tale scopo sono stati scelti biosensori elettrochimici a trasduzione amperometrica, giacché considerata la tecnica più consolidata ed efficace dal punto di vista biologico. Abbiamo inoltre deciso di utilizzare elettrodi “sreen-printed” (SPEs) con supporto ceramico. Uno dei punti più critici nella realizzazione del biosensore risiede nell’immobilizzazione dell’elemento biologico sulla superficie elettrodica in modo tale da mantenere inalterata la sua funzione. Per tale motivo, abbiamo scelto elettrodi costituiti da un elettrodo di lavoro in glassy carbon funzionalizzato con un composito di nanotubi di carbonio, che conferiscono porosità aumentando la superficie disponibile, e nanoparticelle d’oro (CNT/GNP) che permettono il chemiadsorbimento dei biorecettori tramite i residui cisteinici della proteine di interesse, grazie all’elevata affinità dell’oro nei confronti dello zolfo. Uno studio preliminare molto articolato ha indicato l’approccio di tipo competitivo come il più adatto alla rivelazione e quantificazione della proteina target. Abbiamo quindi effettuato una ottimizzazione delle condizioni sperimentali tramite un “disegno sperimentale” a due fattori e tre livelli, stabilendo quali sono le condizioni migliori in termini di inibizione di segnale. Siamo riusciti così ad ottenere un intervallo dinamico di risposta del sensore compreso fra 10 pM e 10 nM, come valori di concentrazione di p53 in competizione. I limiti di rivelazione e quantificazione ottenuti in tampone fisiologico a pH 7.4 sono rispettivamente di 35 (LOD) e 123 (LOQ) pM. Il metodo è stato quindi validato in matrice reale (urina sintetica addizionata di p53), mostrando ottime prestazioni, confrontabili con quelle ottenute in PBS. In questo caso i limiti ottenuti sono stati rispettivamente di 14 (LOD) e 100 (LOQ) pM, indicando assenza di “effetto matrice”. A scopo di validazione è stato anche sviluppato un saggio ELISA a trasduzione spettrofotommerica, trasferendo il protocollo analitico su piastre da 96 pozzetti in policarbonato. La trasposizione sensoristica ha confermato le potenzialità di tali dispositivi che, rispetto all’ELISA convenzionale presentano indubbi vantaggi in termini di versatilità, portabilità della strumentazione e sensibilità analitica.