Transthyretin and Retinol-Binding-Protein system: from functional and structural properties to pathological implications

L’ormone tiroideo tiroxina (T4) e la vitamina A giocano un ruolo fondamentale nella regolazione del ciclo cellulare e nella differenziazione. Il trasporto di queste molecole a livello plasmatico viene garantito da due specifici trasportatori proteici che sono rispettivamente la transtiretina (TTR) e la retinol binding protein (RBP). TTR e RBP vengono prodotte negli epatociti e secrete nel circolo sanguigno, in cui formano un complesso relativamente stabile. Entrambe sono associate a stati patologici: le amiloidosi nel caso della TTR e la cecità notturna e malformazioni congenite dell’occhio nel caso della RBP. In questo lavoro, le proteine del sistema TTR-RBP sono stato studiate sotto differenti aspetti. La prima linea di ricerca sulla TTR ha riguardato la valutazione dell’attività antiamiloidogenica di un composto di sintesi noto come CSP-1103, un derivato clorurato del Flurbiprofene, inizialmente sviluppato da Chiesi Farmaceutici per il trattamento del morbo di Alzheimer. La stabilizzazione dello stato nativo della TTR da parte di questo ligando è stata comparata con quella di altri due farmaci, approvati dalla Food and Drug Administration (FDA): Tafamidis e Diflunisal. Il CSP-1103 possiede una alta affinità per i siti di legame della TTR ed è in grado di stabilizzarne lo stato nativo in prove di denaturazione in vitro e ex vivo, in maniera paragonabile al Diflunisal, ma in minor misura rispetto al Tafamidis. Inoltre, considerando la sua capacità di attraversare la barriera emato-encefalica, l’effetto stabilizzante del CSP-1103 è stato testato su una specifica variante mutante della TTR (A25T) associata all’amiloidosi leptomeningea, caratterizzata dalla deposizione di fibrille nelle leptomeningi. La seconda linea di ricerca ha riguardato la retro-evoluzione della TTR ad idrossiisourato idrolasi (HIUasi), un enzima ancestrale assente nell’uomo per il quale un evento di duplicazione genica ha generato la TTR. Lo scopo è stato quello di verificare la possibilità di ricreare un sito attivo enzimatico nel sito di legame della TTR umana, sostituendo residui della TTR con residui che occupano la stesa posizione nella sequenza amminoacidica delle HIUasi da diverse specie, nelle quali questi residui sono conservati e quindi presumibilmente rilevanti per la catalisi. Il fine ultimo, dal punto di vista applicativo, era quello di ottenere una proteina con uno scaffold proteico umano, non immunogenico, di potenziale impiego terapeutico per il trattamento delle iperuricemie. L’inserimento di cinque mutazioni nel sito di legame della T4, ci ha permesso di ottenere cinque forme mutanti, una delle quali ha mostrato un’attività enzimatica 2000 volte più bassa rispetto a quella dell’HIUasi di Danio rerio, utilizzata come confronto. Questo mutante ha mantenuto la capacità di interagire normalmente con la RBP in accordo con il fatto che l’inserimento delle mutazioni non ha avuto ripercussioni sulla struttura quaternaria della TTR. Riguardo alla RBP, Chou et al. (2015) hanno recentemente identificato due mutanti patologici (A55T e A57T) correlati ad una forma autosomica dominate di microftalmia, anoftalmia e coloboma (MAC). Questi autori hanno suggerito come il ruolo patologico di queste forme mutanti possa essere associato alle forme apo, le quali mostrano una maggiore affinità per il recettore di membrana STRA6, rispetto alla RBP wt. Al fine di chiarire ulteriormente le proprietà alla base della loro patogenicità, le forme mutanti della RBP sono state espresse in E.coli, ed è stato possibile ottenerle in forma nativa mediante un procedimento di unfolding, refolding in presenza di retinolo e cromatografia di affinità, sfruttando per quest’ultima l’interazione TTR-RBP. Le due forme mutanti di olo-RBP che abbiamo analizzato hanno mostrato caratteristiche funzionali simili a quelle descritte da Chou et. al (2015) quali la capacità di interagire con il retinolo e la TTR. Inoltre, abbiamo osservato un alto grado di similarità tra le strutture della olo-RBP A57T e della olo-RBP wt. Nonostante queste caratteristiche, in condizioni denaturanti, le forme mutanti mostrano un maggiore grado di instabilità rispetto alla RBP wt, e questo dato è probabilmente in accordo con le alterazioni patologiche indotte in vivo dalle mutazioni.