Genotossicità ed epigenotossicità di nanomateriali ingegnerizzati

La rapida espansione del campo delle nanotecnologie ha implicato l’ingresso e la successiva diffusione di nanoparticelle (NP) a base di ossidi metallici in ambiente domestico e lavorativo, suscitando di conseguenza una problematica sanitaria rilevante. Gli individui esposti a NP non sono esclusivamente i consumatori finali di prodotti contenenti nanomateriali ma anche lavoratori che possono potenzialmente venire in contatto con NP durante tutte le fasi del ciclo produttivo. L’internalizzazione delle nanoparticelle nel citoplasma può indurre risposta infiammatoria, effetti citotossici, genotossici, epigenotossici e cancerogeni. Questa tesi è incentrata su tre NP a base metallica, NP di biossido di titanio (TiO2 NP), NP di cobalto (II, III) ossido (Co3O4 NP), quantum dots di solfuro di cadmio (CdS NP), il cui uso estensivo in processi industriali rende necessario caratterizzarne approfonditamente gli effetti. Gli effetti delle NP selezionate sono stati saggiati su linee cellulari in vitro rappresentative dei tessuti con più alto rischio associato all’esposizione: A549 (cellule umane di adenocarcinoma polmonare), HepG2 (cellule umane di carcinoma epatocellulare), HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells), HAEC (Human Aorta Endothelial Cells) e cardiomiociti di ratto da espianto primario. Le linee cellulari sono state saggiate per l’induzione di citotossicità (MTS assay), genotossicità (comet assay), induzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS – test in fluorescenza con DCFH-DA) ed effetti epigenotossici. Al fine di valutare le possibili interazioni epigenetiche, questa tesi propone lo sviluppo e successiva applicazione di una nuova metodica basata su un sistema solido ed ampiamente usato come il comet assay. Il protocollo modificato del comet assay alcalino è in grado di rilevare macrovariazioni di metilazione globale in una popolazione di cellule attraverso la digestione con due enzimi di restrizione (HpaII, MspI). È stata saggiata la ripetibilità del metodo e la sua sensibilità nei confronti di variazioni nei livelli della metilazione globale usando due sostanze con azione nota sul metiloma: decitabina (agente demetilante) e cloruro di nichel (NiCl2 – agente ipermetilante). In aggiunta, al fine di verificare se l’interazione con xenobiotici potesse avere effetti anche sui sistemi cellulari di mantenimento del metiloma si è provveduto a saggiare i livelli trascrizionali dei geni delle DNA metiltransferasi (DNMT) tramite RT-PCR real time. Il protocollo modificato del comet assay è stato quindi utilizzato per verificare eventuale attività epigenotossica di Co3O4 NP e TiO2 NP sulla linea cellulare A549. Le NP a base di cobalto e titanio hanno mostrato una bassa citotossicità su tutte le linee saggiate, mentre le NP a base cadmio hanno mostrato una citotossicità più alta con valori di IC50 di circa 14µg/ml. Tutte le NP hanno causato l’induzione di genotossicità, a seguito dell’esposizione, in tutte le linee cellulari valutate. In particolare, la genotossicità indotta da Co3O4 NP e le TiO2 NP è stata rilevata a concentrazioni che non presentavano citotossicità significativa. La maggioranza delle linee cellulari sembri recuperare lo stress genotossico indotto in tempi variabili caratteristici di ogni singola linea cellulare. La linea HAEC esposta a Co3O4 NP ha mostrato l’induzione di ROS e di frammentazione genomica, unitamente a una diminuzione dell’attività metabolica. Delle due NP saggiate (Co3O4 NP e TiO2 NP), solo le Co3O4 NP hanno mostrato effetti a carico del metiloma cellulare. L’esposizione a Co3O4 NP ha determinato nella linea A549 l’induzione di una lieve seppur significativa demetilazione globale. Questa evidenza, unitamente all’aumento dei livelli di ROS e l’induzione di genotossicità riportati, pone la necessità di riconsiderare il rischio associato all’esposizione a nanoparticelle a base di cobalto.