Ruolo dei fattori trascrizionali Abf1 e Fhl1 nella regolazione dei geni per proteine ribosomiali in Saccharomyces cerevisiae

La costruzione di nuovi ribosomi costituisce per ogni cellula un importante investimento energetico, necessario per assicurare l’elevata capacità di sintesi proteica richiesta quando le condizioni di crescita sono in grado di sostenere un’intensa attività metabolica. Dato il notevole dispendio di energia che comporta, la biogenesi del ribosoma deve essere invece tempestivamente repressa in caso di stress o di carenza di nutrienti, in modo da permettere la sopravvivenza delle cellule grazie all’indirizzamento delle scarse risorse disponibili verso le esigenze metaboliche imposte dal cambiamento delle condizioni di crescita. In Saccharomyces cerevisiae, diversamente dalla maggior parte degli altri eucarioti, i meccanismi che consentono la modulazione della biogenesi dei ribosomi agiscono prevalentemente attraverso il controllo trascrizionale coordinato degli oltre 750 geni i cui prodotti sono coinvolti, con funzioni strutturali e non, in questo processo biosintetico. Le strategie regolative richiedono l’intervento di numerosi fattori specifici per ogni classe di geni e permettono il controllo concertato dell’attività di tutte e tre le RNA Polimerasi nucleari. Differenti vie di segnalazione cellulare esercitano un preciso controllo sui diversi regolatori trascrizionali in modo che ogni singolo gene risulti finemente regolato in base alle esigenze della cellula e in maniera coordinata rispetto a tutti gli altri che partecipano alla biogenesi del ribosoma. Numerosi studi hanno finora contribuito alla comprensione degli aspetti regolativi che assicurano il controllo della maggior parte dei 138 geni codificanti per le 79 proteine ribosomiali, i cui promotori presentano siti di legame per il General Regulatory Factor Rap1. Il presente lavoro di tesi si propone invece di contribuire alla individuazione e caratterizzazione degli elementi cis- e trans-regolativi della classe decisamente meno numerosa di geni Rap1-indipendenti, il cui promotore contiene la sequenza riconosciuta da un altro GRF, la proteina Abf1. Grazie ad un iniziale approccio in silico basato sull’analisi filogenetica delle regioni a monte di questi geni, è stato possibile identificare gli elementi che accomunano l’architettura dei promotori di RPL3, RPL4B, RPP1A, RPS22B, RPS28A e RPS28B: il sito di legame per Abf1, un tratto poli(dT) e una sequenza corrispondente al sito di legame per Fhl1, regolatore chiave dei geni RP, situata tra i due elementi precedentemente citati. Attraverso successivi esperimenti in vivo ed in vitro sono state ottenute conferme dell’associazione dei regolatori Abf1 e Fhl1 ad alcuni di questi promotori. Un primo passo verso l’approfondimento dei meccanismi di regolazione trascrizionale dei geni considerati è stato compiuto grazie alla costruzione e all’analisi di espressione di mutanti genomici del promotore: i risultati ottenuti evidenziano il ruolo svolto da Abf1 nell’attivazione trascrizionale di questi geni in condizioni di crescita ottimali e suggeriscono anche un suo possibile contributo al reclutamento di Fhl1. Le analisi condotte hanno inoltre sottolineato la particolarità del gene RPS22B, che ospita in uno dei suoi due introni la sequenza codificante per lo snoRNA snR44. A monte di questo gene è stato identificato un sito di legame per il regolatore Tbf1, la cui presenza potrebbe rappresentare il residuo evolutivo di un precedente assetto regolativo dei geni per proteine ribosomiali, o potrebbe essere richiesta per la regolazione del gene SNR44.