Antitumorigenicità del D-Ribosio e KHCO3 sulla linea di carcinoma mammario umano Hs 578T ed effetti sulla linea d'epitelio mammario umano non tumorale Hs 578BST

Lo scopo del presente lavoro è quello di studiare come la proliferazione cellulare ed il potenziale migratorio-invasivo, considerati due “hallmarks” della linea cellulare tumorale Hs578T, possano venir modificati dal K:D-Rib, soluzione acquosa di KHCO3 e D-ribosio. Il K:D-Rib può essere concepito come un integratore alimentare e data la sua natura è stato da subito chiaro che lo scopo di questo studio dovesse essere una valutazione comparata degli effetti su un modello tumorale ed un non tumorale. Il composto è stato quindi testato anche su un modello cellulare non tumorale Hs578Bst con lo stesso approccio: si è investigato l’effetto del K:D-Rib sulla proliferazione cellulare. Il ruolo del D-ribosio e dello ione potassio (K+) sono ormai ampiamente noti. Il D-ribosio è un aldopentoso, assiste il metabolismo energetico della cellula oltre ad esser un precursore d’alcuni aminoacidi. Lo ione K+ è coinvolto in molti processi tra cui apoptosi, genesi e mantenimento del potenziale di membrana, stabilizza e coordina il folding dei G-quadruplex. Per saggiare l’effetto del K:D-Rib sulla proliferazione delle linee cellulari non ci siamo potuti avvalere dei comuni saggi metabolici (MTT assay, WST-1 assay ecc) in quanto abbiamo dimostrato che il K:D-Rib interagisce con il bromuro di tetrazolio riducendolo a formazan, così facendo si è dimostrato anche il suo potere antiossidante. Per saggiare gli effetti del trattamento con K:D-Rib, si sono utilizzati due modelli cellulari distinti: Hs 578T (carcinoma mammario umano) ed Hs 578Bst (epitelio, mammario umano, non¬ tumorale). La linea Hs 578T è stata mantenuta in coltura e trattata con K:D-rib 5 mM per 50 giorni. Il n° di split è stato utilizzato per valutare gli effetti de K:D-rib. Il controllo è stato splittato 16 volte mentre il trattato è stato splittato 10 volte. Si è poi calcolato il DP (doubling population time), su un trattamento di 14 giorni ed il controllo ha mostrato un tempo di duplicazione di 44 ore mentre il trattato di 59 ore, tempi significativamente diversi. Questo risultato ci ha spinto a studiare l’effetto del K:D-Rib sul potenziale tumorigenico della linea Hs 578T mediante il saggio d’invasione chemotattica. Le cellule sono state pre-trattate per diversi tempi antecedenti il saggio e per altre 48h durante il saggio stesso. Questo esperimento ci ha permesso di affermare che il K:D-Rib, alla concentrazione di 5 mM, interferisce con il potenziale chemioinvasivo della linea cellulare HTB-126 riducendolo circa dell’80% dopo una settimana di trattamento. Nel contempo si è si è messo a punto un metodo per misurare la concentrazione di potassio K+ utilizzando il DNAzima come biosensonsore. Risultati preliminari indicano che il surnatante delle Hs 578T trattate con K:D-Rib 5mM per 48h mostra una concentrazione di DNAzima inferiore rispetto al DMEM (solo terreno di coltura delle cellule) incubato con K:D-Rib 5mM, ma superiore al solo DMEM (solo terreno) ed al surnatante del controllo (Hs 578T non trattate), dimostrando che vi è un uptake cellulare dello ione K+ e che il DNAzima può essere utilizzato come biosensore per lo ione K+. A completamento di questi esperimenti mediante Microscopia a Forza Atomica si è investigata la morfologia della linea cellulare Hs 578T ed in che modo questa potesse modificarsi in relazione al trattamento con K:D-Rib. Da un’attenta analisi si evince che nelle zone prossimali al nucleo delle cellule trattate, sono presenti riarrangiamenti della membrana cellulare ascrivibili a strutture simili a porosomi. Si può ipotizzare che i porosomi e le invaginazioni membranarie ed essi correlate siano il legame di tipo morfologico fra l’upatke di potassio e la modificazione di hallmarks tumorali quali la proliferazione e la chemoinvasione. Si è quindi si è studiato l’effetto del K:D-Rib anche sulla proliferazione della linea di epitelio mammario non tumorale, Hs 578Bst , utilizzando il “n° di split”. Il dato mostra un rallentamento non significativo del trattato e nessun cambiamento morfologico apprezzabile a seguito del trattamento. Non si sono riscontrati effetti neppure con il solo D-ribosio o il solo KHCO3. Infine vendo dimostrato il ruolo antiossidante del K:D-Rib si è deciso di studiare l’effetto protettivo del K:D-Rib contro i danni da radiazioni simulando in laboratorio due sedute di radioterapia. La dose somministrata è stata pari a 4 Gy, due somministrazioni da 2 Gy, in accordo con i protocolli terapeutici convenzionali, per il tumore mammario. Le misure AFM evidenziano evidenti danni alle strutture citoscheletriche connesse con la membrana ed alla membrana stessa, a seguito di un’esposizione pari a 4 Gy. Al contrario le cellule pre-trattate con K:D-Rib ed irraggiate presentano strutture simili al controllo con limitati effetti da radiazioni.