Metodi molecolari per la rilevazione di microrganismi negli alimenti e nell'ambiente

Il ruolo dei microrganismi nella biosfera è di inestimabile importanza. Hanno conquistato tutte le possibili nicchie ecologiche e svolgono un ruolo primario, contribuendo come primi attori al ciclo degli elementi essenziali per la vita. I microrganismi sono anche una fonte di nutrienti, essendo alla base di tutte le catene alimentari ed ecologiche. La scienza biotecnologica moderna e le sue applicazioni si basano sulle proprietà microbiche e sull’impiego dei microrganismi e dei loro processi per scopi specifici e industriali. Anche se la maggior parte di essi apporta benefici all’uomo, in determinate situazioni essi possono provocare danni agli organismi viventi superiori. Per tutti questi motivi la microbiologia diagnostica, che si occupa dell’identificazione e della rilevazione dei microrganismi, riveste un ruolo sempre più importante. E’ noto ormai da tempo che i metodi classici non sono sufficienti a tale scopo, infatti per quanto siano stati studiati terreni di isolamento e arricchimento per i diversi microrganismi coinvolti nelle diverse vie metaboliche, solo una frazione di tali soggetti può essere coltivata in laboratorio e i tempi di analisi sono spesso lunghi. Lo scopo di questa tesi è stato mettere a punto tecniche molecolari per la rilevazione di batteri conosciuti e metodi di studio di comunità microbiche in un ambiente complesso, valutandone l’efficacia e la possibile applicazione reale. Due sono i casi presi in esame: - Salmonella enterica e Campylobacter jejuni nella carne di pollo; - la consistenza e la diversità della comunità microbica di sedimenti di un sistema fluviale eutrofico, in presenza-assenza della macrofita radicata Vallisneria spiralis. Salmonella enterica e Campylobacter jejuni sono microrganismi contaminanti la carne di pollo in grado di causare infezioni alimentari all’uomo, che può venirne a contatto per ingestione di materiale contaminato. L’EFSA (European Food Safety Authority) negli ultimi anni ha intensificato gli studi e le pubblicazioni relative a tali microrganismi patogeni, controllando l’insorgenza delle zoonosi e cercando di mettere a punto sistemi per lo sviluppo di metodi diagnostici per il loro rilevamento negli alimenti. Sulla base di queste indicazioni, nella prima fase del lavoro di tesi sono stati sviluppati e analizzati due metodi per identificare e quantificare S. enterica e C. jejuni, pollo basati su PCR Real Time, qualitativa e quantitativa (qPCR) in colture microbiche pure ed in campioni di pollo. Poiché i geni target sono presenti in singola copia nei rispettivi batteri, è stato assunto che ad ogni copia di amplicone corrispondesse un singolo cromosoma e, di conseguenza, una singola cellula batterica. Il primo metodo, messo a punto in precedenza nella Sezione di Genetica e Biotecnologie Ambientali del Dipartimento di Scienze Ambientali dell’Università di Parma, si basa sulla chimica del SYBR®Green e, in questo lavoro, è stato testato in un laboratorio diverso da quello originale e su macchine per Real Time PCR di marche diverse da quella su cui il metodo era stato messo a punto originariamente. La riproducibilità dei dati ottenuti dalle diverse macchine è stata valutata mediante il calcolo della deviazione standard relativa (RSDR), secondo le indicazioni del CODEX alimentarius e tramite. l’analisi della varianza. Il metodo per la quantificazione di Salmonella in campioni di pollo contaminati artificialmente con questo organismo, si è rivelato trasferibile da una macchina all'altra, anche se ad operare erano sperimentatori diversi. Per Campylobacter, invece, il metodo deve essere ulteriormente migliorato, in quanto solo uno dei campioni analizzati dava risultati riproducibili sulle due macchine utilizzate. Tuttavia, lo stesso metodo, provato presso una delle aziende leader nel campo della produzione e distribuzione di diversi prodotti di carne avicola, si è rivelato adeguato per la rilevazione qualitativa di Campylobacter. L’altro metodo per la rilevazione e la quantificazione di S .enterica e C. jejuni è stato messo a punto utilizzando le sonde TaqMan®, che, oltre a presentare una maggiore specificità rispetto al SYBR®Green, consentono di quantificare contemporaneamente due DNA target nella stessa reazione. I risultati delle analisi, condotte su colture pure dei due microrganismi e su campioni di pollo contaminati con essi, hanno mostrato una buona concordanza tra la qPCR in singolo ed in doppio e i convenzionali metodi microbiologici, per la maggior parte dei campioni analizzati, con un limite di rilevabilità pari a 103 CFU per campione in entrambi i casi. Nella seconda parte di questa tesi sono riportati i risultati di uno studio preliminare sulla consistenza e la diversità della comunità microbica del sedimento in un sistema fluviale eutrofico, in presenza o assenza della macrofita radicata V. spiralis. Lo scopo di questo lavoro è stato sviluppare degli strumenti di analisi che permettano di comprendere il ruolo della comunità microbica, associata al sistema radicale di Vallisneria, e coinvolta nel ciclo dell’azoto. Il lavoro sperimentale è stato svolto in collaborazione della Dott.ssa Elisa Soana (Dottoranda di Ricerca in Ecologia) e del Dott. Marco Bartoli (Università degli Studi di Parma, Dipartimento di Scienze Ambientali). Vallisneria spiralis è un macrofita radicata d’acqua dolce che ha la capacità di crescere in un sistema eutrofico, in condizioni di azoto e nutrienti non limitanti, e nonostante ciò, di trasferire ossigeno a livello radicale, caratteristica che altre macrofite d’acqua dolce ad oggi non hanno mostrato. L’interesse ecologico è indagare il ruolo delle comunità macrofitiche sommerse nella regolazione delle dinamiche biogeochimiche (con particolare riferimento al ciclo dell’azoto) e le relazioni con le comunità microbiche in ecosistemi acquatici caratterizzati da rapida evoluzione in termini di caratteristiche del substrato e disponibilità dei nutrienti inorganici. A tale scopo, lo studio relativo alle comunità microbiche ha inizialmente coinvolto l’isolamento delle specie batteriche, correlate al ciclo biogeochimico dell’azoto, da sezioni di sedimento vegetate da V. spiralis; la preparazione delle colture pure degli isolati batterici e la loro identificazione, attraverso tecniche molecolari. Questo è stato possibile attraverso l’estrazione del DNA genomico da ciascun isolato batterico, l’amplificazione del 16S rDNA, l’analisi dei profili ARDRA seguita dalla selezione dei profili diversamente rappresentati e il sequenziamento del 16S rDNA. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di ottenere dei microrganismi di riferimento, per analisi più dettagliate, come la determinazione dei profili ARISA. In parallelo, è stata svolta una ricerca bibliografica per la selezione dei geni batterici coinvolti nelle reazioni principali del ciclo biogeochimico dell’azoto e la selezione dei primer per la futura messa a punto di una Real Time PCR multiplex. Infine, la tecnica ARISA è stata applicata a sedimenti campionati da zone vegetate e sedimenti prelevati da zone non vegetate, in due momenti importanti per lo sviluppo della macrofita radicata (in fase esponenziale di crescita e alla massima produzione in termini di biomassa) per conoscere ed evidenziare possibili differenze sulla popolazione microbica totale. I risultati ottenuti, sottoposti ad un’approfondita analisi statistica, hanno dimostrato che la presenza di V. spiralis influisce, seppur in modo limitato, sulla diversità microbica, soprattutto in base allo stadio di sviluppo della pianta stessa.M