Biochemical characterization of human kynurenine aminotransferase II (hKAT II): a drug target for cognitive diseases

L’attività di ricerca svolta durante il corso di dottorato ha riguardato la caratterizzazione biochimica dell’enzima chinurenina aminotransferasi II di origine umana (hKAT II). hKAT II è un enzima piridossal 5’-fosfato (PLP)-dipendente, coinvolto nella via metabolica di degradazione del triptofano, nota come via della chinurenina, che porta alla formazione di NAD+. Alcuni intermedi di questa via metabolica sono neuroattivi e hanno recentemente assunto particolare interesse per il loro coinvolgimento nell’insorgenza di malattie neurodegenerative. Tra questi metaboliti neuroattivi vi è l’acido chinurenico (KYNA), che deriva dalla transaminazione irreversibile della L-chinurenina (KYN), catalizzata dall’enzima KAT. Fino ad oggi nel cervello dei mammiferi sono state identificate quattro isoforme di questo enzima, denominate KAT I-IV. KAT II è il principale enzima responsabile della sintesi di KYNA a livello cerebrale. KYNA agisce come antagonista di alcuni sottotipi di recettori glutamatergici e colinergici e diversi studi in vivo hanno dimostrato che alterazioni nella sintesi di KYNA sono in grado di influenzare le funzioni cognitive mediate da questi recettori. L’enzima KAT II è quindi un potenziale target farmaceutico per il trattamento di condizioni neuropatologiche caratterizzate da eccesso di KYNA e ipofunzionalità della neurotrasmissione colinergica e glutamatergica, quali schizofrenia e disturbi cognitivi. Nonostante queste importanti implicazioni biologiche e farmacologiche, sino ad oggi non è stata effettuata una estesa caratterizzazione biochimica di questo enzima. Inoltre, solo pochi composti sono attualmente disponibili come inibitori di hKAT II. I principali obiettivi del presente progetto di tesi sono stati i) l’ottimizzazione della resa di espressione mediante un innovativo sistema di crescita cellulare (EnBase BioSilta), ii) la caratterizzazione delle proprietà spettroscopiche di hKAT II in soluzione e allo stato cristallino, iii) la valutazione della propensione di hKAT II a catalizzare reazioni secondarie di b-eliminazione, iv) la messa a punto di nuovi saggi di attività di più facile utilizzo rispetto a quello attualmente riportato in letteratura e applicabili alla determinazione dei parametri catalitici, v) la determinazione dei meccanismi e delle costanti di legame di alcuni composti proposti essere inibitori specifici di hKAT II, e vi) lo sviluppo di un metodo rapido e semplice per lo screening su larga scala (high-throughput screening, HTS) di librerie di composti al fine di individuare nuove molecole in grado di inibire hKAT II. Gli studi condotti durante questo lavoro di tesi hanno permesso di ottenere una dettagliata caratterizzazione biochimica di hKAT II e di sviluppare nuovi saggi di attività applicabili allo sviluppo di farmaci per il trattamento terapeutico di schizofrenia ed altri disturbi cognitivi.