Analisi funzionale in Saccharomyces cerevisiae delle varianti missenso nei “tumor suppressor genes” SDH

Il complesso II della catena respiratoria, cII, (succinato-ubichinone ossido reduttasi o succinato deidrogenasi, SDH) è l’enzima che lega l’attività del ciclo di Krebs e il trasporto di elettroni nella membrana mitocondriale: SDH è una ferro-zolfo flavoproteina che catalizza l’ossidazione del succinato a fumarato e la riduzione dell’ubichinone a ubichinolo. L’enzima è costituito da quattro sub-unità strutturalmente e funzionalmente diverse tutte codificate da geni nucleari (SDHA-SDHD): le sub-unità SdhA e SdhB formano il dimero catalitico ancorato alla membrana interna sul lato rivolto verso la matrice, mentre le sub-unità SdhCe SdhD ancorano il dimero catalitico alla membrana. Nonostante la vasta conoscenza sulle proprietà strutturali e catalitiche del complesso, solo di recente sono stati identificati due assemblatori specifici per SDH: SDHAF1 e SDHAF2. Difetti genetici dei singoli componenti della succinato deidrogenasi, sono causa nell’uomo di patologie diverse. Mentre mutazioni eterozigoti nei geni che codificano per le sub-unità B, C e D predispongono a neoplasie ereditarie come feocromocitoma (PHEO: pheochromocytoma) e paraganglioma (PGL), chiamate “PHEO-PGL syndrome”, mutazioni omozogoti in SDHA causano la sindrome di Leigh, un’encefalopatia sub-acuta necrotizzante (SNEM), una malattia neurodegenerativa progressiva infantile, anche se di recente un caso di paraganglioma è stato associato con una mutazione in SDHA. Anche mutazioni nei geni che codificano per i fattori di assemblaggio sono state associate sia a una tipica malattia mitocondriale, sia al cancro: mutazioni in SDHAF1causano la leucoencefalopatia infantile e mutazioni in SDHAF2 sono state associate a paraganglioma ereditario. PGL e PHEO spesso presentano una inattivazione somatica dell’allele wild-type, questo indica che i geni SDH hanno il tipico comportamento dei geni tumor suppressor, in quanto hanno bisogno di due eventi per la loro inattivazione. Test genetici per mutazioni nei geni di suscettibilità di questi tumori sono ormai una pratica comune: per quanto riguarda le sindromi PGL e PHEO sono note un ampio spettro di mutazioni in SDHB, C e D. Oltre alle mutazioni che sono sicuramente causa della malattia, come mutazioni non senso o delezioni, con lo screening delle mutazioni si sono spesso trovate sostituzioni missenso, che sono di incerto significato. Sono necessari, quindi, studi funzionali per trovare il legame causa effetto tra queste sostituzioni missenso e la malattia. Diversi studi hanno dimostrato che il lievito è un sistema modello in vivo adatto per validare il significato patogeno delle mutazioni nei geni coinvolti in malattie mitocondriali, grazie alla somiglianza di ortologhi di lievito di geni umani coinvolti nella fosforilazione ossidativa, nonché la capacità del lievito di sopravvivere alla perdita della funzione respiratoria e del DNA mitocondriale, a condizione che sia disponibile una fonte di carbonio fermentabile. In studi precedenti il lievito è stato usato come modello per studiare le conseguenze funzionali di mutazioni nei geni SDH sull’attività della succinato deidrogenasi, così come sull’attività respiratoria mitocondriale, questi studi sono possibili perché il complesso SDH è altamente conservato. Anche in lievito la succinato deidrogenasi è codificata da quattro geni nucleari SDH1-4 che sono stati isolati e caratterizzati. Recentemente per ovviare alla mancanza di una linea cellulare di derivazione della cresta neurale da poter utilizzare per valutare l’importanza patogena di una nuova mutazione germinale missenso nel gene SDHB in un paziente affetto da tumore glomico si è utilizzato il lievito per studi funzionali. In questo lavoro di tesi sono riportate le caratteristiche molecolari di una serie di mutazioni nei geni SDHB, C e D il cui effetto è stato studiato in lievito, valutando il fenotipo di crescita ossidativa, l’attività della succinato deidrogenasi, il consumo di ossigeno e di altri fenotipi come la sensibilità allo stress ossidativo e la mutabilità del mtDNA.