Il contributo delle biotecnologie alla "carta di identità" dell'olio di oliva

Lo sviluppo di sistemi di tracciabilità molecolare per ricostruire attraverso la filiera la storia produttiva di un alimento hanno ormai assunto una funzione importante nel garantire l’origine e la sicurezza dei prodotti alimentari. La tracciabilità attraverso analisi molecolari costituisce un vantaggio rispetto al sistema attuale basato prevalentemente sull’uso di documentazione cartacea ed è un valido strumento in appoggio alle tecniche analitiche classiche. Lo scopo di questa tesi è stato quello di sviluppare e implementare metodologie genetiche e molecolari per la tracciabilità dei prodotti alimentari, prendendo come caso di studio l’olio di oliva. L’olivo (Olea europaea L.) è una delle piante più importanti per la produzione di olio nell’area del Mediterraneo. La sua coltivazione è in forte espansione e la richiesta dei prodotti da esso derivati è in significativo aumento, dato il loro utilizzo nelle diete alimentari grazie agli effetti benefici da esso dimostrati per la salute umana. La tutela della autenticità di origine di questo prodotto è quindi ormai una concreta esigenza, recepita anche dalla Unione Europea che ha istituito i marchi DOP (Denominazione di Origine Protetta) e IGP (Indicazione Geografica Protetta) per proteggere gli oli di maggior pregio. Come tutti i prodotti di un certo valore anche l’olio di oliva può essere soggetto a frodi ed adulterazioni, ad esempio l’addizione di oli ottenuti da specie diverse dall’olivo o da cultivar di scarso pregio. L’analisi dei residui di DNA contenuti nell’olio di oliva può quindi consentire di individuare le cultivar di olivo di origine presenti o l’addizione di eventuali oli provenienti da altre specie. La prima fase per svolgere un’analisi molecolare del DNA contenuto nell’olio è lo sviluppo e l’ottimizzazione di un metodo estrattivo. Un metodo commerciale, basato sull’uso di un kit e uno sperimentale sviluppato in laboratorio sono stati comparati per valutare l’effetto matrice dell’olio sulla resa estrattiva, il livello di purificazione del DNA, la quantità di campione iniziale per avere una resa adeguata di DNA, l’eventuale presenza di inibitori nell’estratto, i costi e i tempi di estrazione. Metodi di estrazione del DNA sono stati applicati anche a oli di semi comunemente utilizzati per le sofisticazioni al fine di verificarne la presenza nell’olio di oliva. L’analisi ha portato alla individuazione di un metodo di estrazione efficiente per il recupero del DNA sia dall’olio di oliva che dall’olio di semi. Amplificazioni con primer disegnati per produrre ampliconi di diversa grandezza hanno evidenziato che dimensioni inferiori alle 100 bp consentono di amplificare con successo il DNA bersaglio in estrazioni da olio di oliva e di semi. Una volta sviluppato e validato il metodo di estrazione, il lavoro è stato articolato in due filoni di ricerca: i) sviluppo di metodi per identificare le adulterazioni con oli di specie diverse dall’olio di oliva; ii) sviluppo di metodiche basate sull’uso marcatori molecolari per stabilire la composizione varietale di oli di oliva pregiati. Attraverso la tecnica della Real-Time PCR, l’analisi dei profili di dissociazione degli ampliconi ha consentito l’identificazione di tracce di DNA di nocciola, mais e girasole in miscele di olio di oliva. L’analisi ha portato alla individuazione di temperature di dissociazione caratteristiche per gli ampliconi derivanti dai tre oli di interesse, sia in PCR singola che duplex. L’efficienza di amplificazione delle reazioni sviluppate è risultata compresa tra 89.91% e 97.04% con un limite di rivelazione di 6.25 ng di DNA bersaglio. La seconda parte del lavoro di ricerca svolto è stata mirata allo sviluppo di metodologie per determinare la composizione varietale di un olio utilizzando marcatori molecolari microsatelliti. Undici microsatelliti, nove nucleari e due cloroplastici, sono stati utilizzati per analizzare 21 oli di oliva monovarietali. Sono stati valutati diversi parametri: l’amplificabilità in PCR, la corrispondenza allelica con la foglia di olivo della cultivar di origine dell’olio e la riproducibilità dei profili microsatelliti in diverse estrazioni di olio. L’affidabilità dei profili SSR (Simple Sequence Repeat) dell’olio d’oliva può essere stabilita solo nell’analisi di più estrazioni di DNA indipendenti dallo stesso campione. L’olio di oliva contiene, infatti, un ampio numero di inibitori di PCR, che potenzialmente possono portare a profili artefatti e non affidabili. I risultati hanno mostrato che la corrispondenza tra profili degli oli e quelli delle piante di origine sul totale delle repliche di PCR eseguite era vicina al 32% e che l’estrazione di DNA dall’olio d’oliva era il passaggio limitante per l’affidabilità dei profili SSR dovuta alla complessità della matrice analizzata. La riproducibilità di un profilo SSR con tre diverse estrazioni oscilla tra il 70% e il 30% e dipende dal tipo di microsatellite usato. Gli stessi parametri dipendono fortemente anche dal tipo di olio di oliva analizzato: l’amplificabilità varia dal 76% al 12%, mentre la corrispondenza con la foglia della cultivar di origine varia dal 72% al 2%. Questo significa che la diversa composizione chimica degli oli può influire sulla qualità del DNA estratto e quindi sulla successiva amplificazione in PCR. I microsatelliti cloroplastici presentano un’efficienza sia in termini di amplificabilità che di corrispondenza con la cultivar di origine dell’olio nettamente più alta rispetto a quella dei marcatori nucleari. I valori percentuali sia di amplificabilità che di corrispondenza totale sono rispettivamente del 64% e del 69% per i due marcatori testati. La riproducibilità si attesta oltre il 60%. Poiché il DNA nell’olio di oliva è degradato, per migliorare l’efficienza dell’analisi molecolare si è cercato di ridurre le dimensioni degli ampliconi relativi ai microsatelliti. Sono state perciò ridisegnate nuove coppie di primer più vicine alla ripetizione microsatellitare riducendo le dimensioni dell’amplicone. Questi nuovi primer hanno portato ad un certo miglioramento dell’amplificabilità e della corrispondenza totale con la cultivar di origine dell’olio. Nell’ultima parte del lavoro è stata valutata la possibilità di utilizzare la Real-Time PCR per quantificare le cultivar di olivo presenti in miscele di olio. A questo scopo è stato preso in considerazione un marcatore SNP (Single Nucleotide Polymorphism) identificato all’interno della sequenza del gene per l’oleosina su cui sono state disegnate due sonde TaqMan-MGB specifiche per le due varianti alleliche. Dopo l’ottimizzazione della reazione e le prove su miscele di DNA estratto da foglia di olivo, le analisi sono state condotte su miscele di oli prodotti dalle cultivar con le due varianti alleliche del polimorfismo SNP. Le reazioni condotte in duplex, hanno mostrato come le amplificazioni fossero specifiche per i singoli genotipi ma che l’amplificazione del DNA non corrispondeva alle quantità relative delle cultivar nelle miscele di olio.