Identification and transcriptional regulation of eukaryotic small nuclear RNA genes

L’attività di ricerca descritta in questo lavoro di tesi riguarda la regolazione trascrizionale di geni codificanti per small nuclear RNA (snRNAs), un gruppo di trascritti abbondanti, non codificanti proteine, che formano il cuore dello spliceosoma, deputato alla rimozione di introni dai pre-RNA messaggeri. Gli snRNA (U1-U6) sono sintetizzati dalla RNA Polimerasi (Pol) II, tranne lo snRNA U6, il cui gene è trascritto dalla RNA Polimerasi III. Rispetto agli snRNAs nei metazoi, si conosce poco della sintesi degli snRNA negli organismi unicellulari. Nel primo lavoro descritto in questa tesi abbiamo identificato putativi elementi regolatori nei promotori dei geni di lievito trascritti dalla Polimerasi II attraverso un “footprinting filogenetico”. L’analisi ha identificato alcuni blocchi conservati di sequenze corrispondenti ai consensi dei siti di legami per “general regulatory factors” (Rap1, Abf1, Reb1) ed alcuni elementi regolatori coinvolti in differenti pathways metabolici (RRPE - ribosomal RNA processing element; PACE - Proteasome Associated Control Element). Per capire più a fondo il coinvolgimento nella trascrizione dei putativi elementi regolatori così identificati, abbiamo preparato versioni marcate di due geni di S. cerevisiae codificanti per snRNA, LRS1 (codificante per U2 snRNA) e SNR7 (codificante per U5 snRNA), da utilizzare come geni reporter per analisi di espressione in vivo. L’analisi mutazionale degli elementi conservati nella regione a monte dell’inizio della trascrizione, ha rivelato la loro effettiva influenza nella trascrizione, probabilmente attraverso la creazione o il mantenimento di una regione libera da nucleosomi. La seconda parte di questa tesi si è focalizzata sulla caratterizzazione di nuove unità trascrizionali “tipo snRNA” nel genoma umano. Attraverso una ricerca computazionale per elementi tipici dei promotori dei geni per snRNAs (proximal sequence element and distal sequence element), abbiamo identificato alcune putative unità trascrizionali. Abbiamo analizzato le proprietà di trascrizione in vitro di alcune di queste unità in estratti nucleari da linee cellulari HeLa e SKNBE, mostrando come gli elementi promotori fossero effettivamente in grado di supportare la trascrizione da parte della Polimerasi III. In particolare abbiamo definito due nuovi RNA non codificanti, 17A e 51A, lunghi rispettivamente 171 e 423 nucleotidi, e la struttura dei promotori di altri due geni, 38A e 29A. Alcune delle unità trascrizionali caratterizzate (17A, 38A, 51A) sono interne a geni codificanti per proteine in zone dove avvengono fenomeni di splicing alternativo, mentre un’altra (29A) è stata identificata come una Alu. Ulteriori studi sono necessari per caratterizzare più in profondità tali unità trascrizionali in vivo e la funzione dei loro prodotti, in quanto la loro posizione suggerisce un possibile ruolo regolatorio ed una complessità crescente del trascrittoma della Polimerasi III.