Characterization of non-symbiotic hemoglobins from Arabidopsis thaliana in solution and encapsulated in silica gels

L’attività di ricerca svolta durante il corso di Dottorato è stata focalizzata sulla caratterizzazione delle emoglobine AHb1 e AHb2 di Arabidopsis thaliana, tramite l’uso di metodi spettroscopici steady state e risolti nel tempo. Gli spettri UV-visibile delle due emoglobine nello stato deossigenato hanno mostrato che, a differenza di AHb2, AHb1 non è completamente esacoordinata in soluzione. Le cinetiche di legame del monossido di carbonio (CO) ad AHb1 e AHb2 sono state misurate tramite lo stopped flow rapid mixing e la laser flash fotolisi, a differenti condizioni di temperatura e concentrazioni di CO. I risultati hanno messo in evidenza che queste due emoglobine hanno una reattività notevolmente diversa nei confronti dei ligandi esogeni. Le misure di stopped flow hanno confermato la co-esistenza in AHb1 deossigenata della forma pentacoordinata ed esacoordinata dell’eme. L’ampiezza molto piccola della fase geminata osservata tramite flash fotolisi per AHb1 ha suggerito la presenza di un canale relativamente aperto che mette in comunicazione la cavità distale dell’eme con l’esterno. Per AHb2, le fluttuazioni della proteina sono risultate cruciali nell’influenzare la migrazione del ligando dall’eme al solvente, come testimoniato dalla dipendenza dalla temperatura dell’ampia fase di rebinding geminato. È stata osservata per entrambe le emoglobine la possibilità di una competizione per il legame con l’eme tra il CO fotodissociato e l’istidina distale. Sono state inoltre effettuate misure di rebinding del CO a campioni di AHb1 e AHb2 incapsulati in gel di silice e immersi in glicerolo. Il confronto tra le cinetiche misurate per AHb1 e AHb2 in soluzione e incapsulate in gel di silice ha sottolineato i ruoli svolti dalle fluttuazioni della matrice proteica e dalla migrazione del ligando. L’incapsulazione in gel di silice non ha alcun effetto sulle cinetiche di rebinding ad AHb1, mentre causa un notevole aumento dell’ampiezza della fase geminata per AHb2. L’uso del glicerolo produce un consistente allargamento della fase geminata per entrambe le proteine, in particolar modo per AHb1, che presenta un rebinding geminato multifasico, ad evidenza della presenza di più siti di docking in quale il ligando può essere temporaneamente allocato. Le strutture di AHb1 e AHb2, modellate sulla base della struttura dell’emoglobina di riso, così come la struttura cristallografica di AHb2 C75S da noi risolta, mostrano un differente sistema di cavità interne compatibile con le cinetiche di legame osservate. Al fine di mettere in evidenza quale sia il ruolo della coordinazione bis-istidinica dell’eme nel modulare il legame di ligandi esogeni, abbiamo effettuato degli esperimenti sui mutanti di AHb1 sulla HisE7 e sulla PheB10. La mutazione dei residui della cavità distale producono un aumento del legame geminato ed una velocità di legame bimolecolare apparentemente più alta rispetto alla proteina wild type. Inoltre, abbiamo mostrato che AHb1 ha un’elevata reattività verso l’ossigeno ed il monossido di azoto, suoi potenziali ligandi fisiologici. In conclusione, i dati cinetici e strutturali acquisiti supportano l’ipotesi di una attività NO-diossigenasica per AHb1, mentre il ruolo di AHb2 rimane poco chiaro.