Applicazione di metodologie molecolari nella diagnosi di malattia da infezione associata a Clostridium difficile

Clostridium difficile è un bacillo anaerobio, Gram-positivo, sporigeno, responsabile di una malattia diarroica e/o di coliti di varia gravità fino alla colite pseudomembranosa nonché uno dei maggiori responsabili di epidemie intraospedaliere. I principali fattori di virulenza di C. difficile sono rappresentati da due tossine principali: l’ enterotossina A (TcdA), la citotossina B (TcdB), codificate dai geni tcdA e tcdB localizzati nel Locus di patogenicità di C. difficile (PaLoc), e da una tossina addizionale, la tossina binaria (CDT), sintetizzata a partire da due diversi geni, cdtA e cdtB, localizzati esternamente al PaLoc. Alcuni ceppi di C. difficile producono tossine A e B varianti e presentano delezioni e/o mutazioni anche in altre regioni del PaLoc. Dal momento che queste mutazioni sono più frequenti in presenza dei geni codificanti per la tossina binaria, la presenza dei geni cdtA and cdtB è pertanto considerata un buon indicatore per la rivelazione di ceppi varianti di C. difficile. Ad oggi sono stati identificati 27 tipi di varianti, denominate da I a XXVII In questo studio sono stati analizzati 438 ceppi di C. difficile, isolati nel corso di setti anni (2000-2006) da 334 pazienti. Per caratterizzare la tossinogenicità dei ceppi, sono state applicate una duplex PCR per la ricerca dei geni tcdA e tcdB ed una PCR in grado di rilevare i geni cdtA e cdtB. Inoltre, è stata eseguita mediante PCR-ribotyping la tipizzazione dei ceppi isolati, allo scopo di tracciare un quadro epidemiologico sulla circolazione dei ribotipi di C. difficile nell’azienda ospedaliero-universitaria di Parma. Infine, è stato approfondito lo studio molecolare dei ceppi di C. difficile risultati varianti (cdtA/B+) con l’analisi del PaLoc mediante toxinotyping e successiva analisi del gene regolatore negativo tcdC, nonché con la verifica della loro sensibilità in vitro ad alcuni chemioantibiotici, fluorochinoloni in particolare come “marker” di patogenicità. Dei 438 ceppi complessivamente esaminati, 390 sono risultati tossinogenici e di questi 125 (32,1%) hanno presentato i geni codificanti per la tossina binaria, che caratterizza i ceppi varianti. Questi ultimi rappresentano il 44% dei ceppi tossinogenici isolati negli anni 2001-2003 e solo il 13% dei ceppi isolati negli anni 2004-2006, un dato che appare in controtendenza rispetto a quelli osservati in altri Paesi. Analizzando i 438 ceppi mediante PCR-ribotyping sono stati trovati 76 differenti ribotipi, arbitrariamente denominati. In particolare, nell’ambito dei 125 ceppi ctdA+ ctdB+ sono stati trovati 8 differenti ribotipi. Il ribotipo più diffuso tra i ceppi varianti è il ribotipo 1, che caratterizza il 94,4% di questi ceppi (118 su 125 totali); di questi ultimi 103 ceppi (82,4%) appartengono al sottotipo 1a risultato responsabile dell’epidemia, che ha coinvolto 15 pazienti ricoverati nei Reparti geriatrici (dic. 2002 - apr. 2003). I nostri ceppi ribotipo 1a sono stati riclassificati mediante pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) e rinominati internazionalmente mediante PCR-ribotyping come NAP7/ribotipo 078. Quarantatrè dei 125 ceppi potenzialmente CDT+ sono stati selezionati, in base al ribotipo ed all’appartenenza allo stesso paziente, per le successive fasi di analisi del PaLoc e della sensibilità in vitro ai chemioantibiotici. Di questi l’ 86% ha mostrato di appartenere al tossinotipo V, che caratterizza anche la totalità dei ceppi ribotipo 1, mentre quattro sono stati tipizzati come tossinotipo XXIV ed hanno mostrato ribotipi differenti: 5 (2 ceppi), 11 e 16. Relativamente all’analisi mediante PCR-ribotyping dei 313 ceppi non varianti è stata rilevata la presenza di 4 ribotipi predominanti: il ribotipo 13 (45 ceppi, 14,4%), il ribotipo 17 (85 ceppi, 27,3%), il ribotipo 18 (32 ceppi, 10,3%) e il ribotipo 33 (28 ceppi, 9%). Tra questi, un ceppo appartenente al ribotipo 17 è risultato responsabile di una epidemia, che ha coinvolto 42 pazienti ricoverati nei Reparti pneumologici (apr.-sett. 2006). L’analisi del gene regolatore negativo tcdC ha messo in evidenza che i ceppi ribotipo 1 tossinotipo V posseggono un allele, già descritto in letteratura, denominato A1 che, oltre ad una delezione di 39 pb, presenta una mutazione non senso con la conseguente produzione di una proteina tronca non funzionale. Il quadro molecolare emerso suggerisce che questi ceppi sono da considerarsi iperproduttori delle tossine principali A e B. Questi ceppi ribotipo 1a tossinotipo V si sono dimostrati anche altamente resistenti ai fluorochinoloni, come riportato in letteratura. Una variabilità maggiore, al contrario, si è osservata con i ceppi che presentavano ribotipo diverso da 1. Sono state trovate, infatti, 5 nuove sequenze alleliche e tre proteiche non ancora descritte in letteratura. Inoltre, da segnalare è il ceppo ribotipo 2 tossinotipo XXIV, che ha presentato mutazioni insolite per questo tossinotipo, normalmente dotato di un PaLoc identico a quello del ceppo VPI 10463. Interessante è stato anche ritrovare in un ceppo ribotipo 2 un nuovo tossinotipo, non ancora descritto in letteratura. Il nostro studio sottolinea inequivocabilmente l’importanza dell’analisi molecolare, quando condotta per monitorare attentamente la circolazione dei ceppi di C. difficile in ambiente ospedaliero e particolarmente di quelli ipervirulenti, come dimostrano i ceppi Nap7/Ribotipo078 tossinotipo V, comparsi nel nostro ospedale nel 2002-2003, responsabili di una grave epidemia nosocomiale.